Tecnologia DNA ricombinante

MUTAZIONI
La fedeltà della replicazione del DNA dipende dalla DNA polimerasi e dalle
loro capacità di correzione del prodotto, funzioni essenziali per trasmettere in
modo accurato l’informazione genetica durante la divisione cellulare.
Il DNA può essere
modificato da fattori ambientali, come agenti alchilanti
e radiazioni ionizzanti.
Per esempio, le radiazioni UV
(200-300 nm) innescano la formazione di un
anello ciclobutilico tra residui di timina adiacenti sulla stessa catena di DNA,
generando un dimero di timina intracatena.
Anche se con frequenza minore, dimeri di citosina o di timina-citosina
( dimeri di pirimidina) distorcono localmente la struttura a basi appaiate del
DNA interferendo con la trascrizione e la replicazione.
1
Il dimero ciclobutiltimina
I legami covalenti lunghi circa 1,6 A, che uniscono gli anelli di timina sono molto più
corti rispetto alla normale spaziatura di ( 3,4 A ) che di solito intercorre tra gli anelli
di due basi impilate nel DNA ; si ha quindi una distorsione locale della sruttura del
2
DNA.
MUTAGENESI CHIMICA
Il danno al DNA prodotto dai mutageni chimici , sostanze che inducono mutazioni,
rientra nell’ambito di due classi principali:
1 ) Mutazioni puntiformi
2 ) Mutazioni per delezione o per inserzione
1 ) Mutazioni puntiformi in cui una coppia di basi sostituisce un’altra
ulteriormente ripartite in:
a ) Transizioni in cui una purina ( o una pirimidina ) è sostituita da una base della
stesso tipo.
b) Trasversioni in cui una purina viene sostituita da una pirimidina o viceversa.
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1) Le mutazioni puntiformi possono derivare dal trattamento di un
organismo con un analogo di una base o con una sostanza che modifica
chimicamenta una base.
Transizione
L’analogo
5-bromouacile (5BU) ricorda stericamente la timina (5metiluracile), ma, sotto l’influenza del suo atomo di Br elettronegativo,
assume spesso una forma tautomerica che si appaia con la guanina
invece che con l’adenina.
Quando il 5BU viene incorporato nel DNA al posto della timina, può
indurre la transizione A T
seguono.
G
G nei cicli di replicazione dell’RNA che
A volte il 5BU viene incorporato nel DNA al posto della citosina,
generando in questo caso una transizione G C
A
T.
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La forma chetonica del 5BU (a sinistra ) è la forma più comune. Il 5BU può
assumere anche la forma enolica ( a destra ), che si appaia con la guanina.
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Una causa di mutazioni puntiformi deriva dal trattamento del DNA con ac. nitroso
In soluzione acquosa l’acido nitroso (HNO2) deammina ossidativamente le
ammine primarie aromatiche e quindi converte la citosina in uracile e l’adenina
in ipoxantina, un composto simile alla guanina. Il trattamento del DNA con acido
nitroso genera la transizione A -T G - C.
Indipendentemente dalla sua potenziale attività mutagenica, il nitrito ( la base
coniugata dell’ac. nitroso ) viene usato per conservare cibi, in quanto impedisce
la crescita del Clostridium botulinum, che causa il botulismo.
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Le trasversioni
L’alchilazione della posizione N7 di un nuclceotide purinico rende il
suo legame glucosidico sensibile all’idrolisi, favorendo la perdita della
base.
La purina persa viene sostituita con una pirimidina.
E’ stato stimato che, anche in assenza di agenti alchilanti in ogni
cellula dell’uomo, venga idrolizzato il legame glicosidico di circa 10000
dei 3,2 miliardi di nucleotidi purinici presenti nel genoma umano per
idrolisi spontanea.
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2) Le mutazioni per delezione o inserzione
sono generalmente causate da agenti intercalanti come per esempio
la proflavina.
La distanza tra due coppie di basi consecutive viene grosso modo
raddoppiata se si intercala tra di loro uno di questi agenti.
La replicazione di questo DNA distorto determina l’inserzione o la
delezione di uno o più nucleotidi nella catena polinucleotidica di nuova
sintesi.
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CARCINOGENESI
Non tutte le alterazioni del DNA hanno conseguenze fenotipiche.
Le mutazioni in segmenti del DNA che non codificano spesso, non sono
osservabili.
Anche quando la sequenza di una proteina viene alterata, la sua funzione
può essere preservata se la sostituzione avviene su un’ansa superficiale.
Una sola mutazione puntiforme però , se localizzata in modo opportuno può
modificare irreversibilmente il metabolismo cellulare, causando per esempio
una neoplasia.
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Test di Ames
Circa 109 batteri Salmonella typhimurim
sono sparsi su una piastra di coltura priva di
istidina.
Se nel terreno di coltura è presente un
mutageno, a lcuni batteri his- diventeranno
his+, e potranno essere identificati in quanto
dopo due giorni a 37° avranno prodotto una
colonia visibile a occhio nudo.
La mutagenicità della sostanza viene poi
valutata in base al numero di queste colonie
sottratto il numero di colonie dovute a
reversione spontanea in assenza di
mutageno.
Molti composti non carcinogenici sono
convertiti in sostanze carcinogeniche nel
fegato o in altri tessuti mediante una varietà
di reazioni di detossificazione.
Nel test di AMES vengono quindi aggiunte
piccole quantità di omogenato di fegato di
ratto per riprodurre amleno in parte il
metabolismo dei mammiferi.
Circa l’80% dei composti che sono risultati
carcinogenici negli esperimenti con animali 10
sono anche mutageni al test di AMES
RIPARAZIONE DEL DNA
I danni subiti dal DNA devono essere riparati per mantenere l’integrità della
informazione genetica.
A. RIMOZIONE DIRETTA DEL DANNO
Alcuni enzimi riconoscono le basi nucleotidiche modificate presenti nel DNA e
ripristinano il loro stato originale. Per esmpio la base alchilata
O6-metilguanina
determina di frequente l’incorporazione di timina invece che di guanina durante la
replicazione del DNA.
La base alchiata viene riconosciuta dalla O6-metilguanina-DNA metiltrasferasi,
che trasferisce direttamente il gruppo metilico modificante a uno dei residui di
cisteina.
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B. RIPARAZIONE PER
ELIMINAZIONE DI NUCLEOTIDI
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procarioti
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B. RIPARAZIONE PER ELIMINAZIONE DI NUCLEOTIDI
I dimeri di pirimidina possono essere rimossi mediante la riparazione per
eliminazione di nucleotidi ( riparazione per scissione, NER ).
Dal DNA viene eliminato un oligonucleotide contenente la lesione e poi il
tratto a catena singola che ne risulta viene riempito con nuovi nucleotidi.
In E. coli i dimeri di pirimidina sono identificati da un enzima multisubunità,
il prodotto dei geni uvrA, uvrB e uvrC.
Questa endonucleasi UvrABC, rompe la catena del DNA con il dimero in
una reazione che richiede ATP, scindendo il settimo ponte fosfodiestere
prima del dimero verso l’estremità 5’ e il quarto ponte fosfodiestere dopo il
dimero verso l’estremità 3’.
Il nucleotide rimosso viene poi rimpiazzato per azione di una DNA
polimerasi, probabilmente Pol I, e seguita dalla DNA ligasi.
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Meccanismo di riparazione per eliminazione di nucleotidi (NER) che rimuove
i dimeri di timidina.
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eucarioti
16
La riparazione per eliminazione negli eucarioti
richiede qualcosa come 16 polipeptidi e rimuove da 24 a 32 nucleotidi dalla
catena del DNA danneggiato.
Difetti del sistema NER sono associati a due patologie umane.
XERODERMA PIGMENTOSO ( XP )
Malattia ereditaria
principalmente caratterizzata dall’incapacità delle cellule
della pelle di riparare le lesioni del DNA causate dalla luce UV.
Gli individui con questa malattia autosomica recessiva sono estremamente
sensibili alla luce del sole.
Durante l’infanzia essi sviluppano marcate alterazioni alla pelle come
lentiggini, ispessimenti e cheratosi ( un tipo di tumore della pelle ), insieme a
danni agli occhi, ad esempio opacizzazione e ulcerazione della cornea; con
probabilità 200 volte superiore alla media sviluppano tumori della pelle con esito
fatale.
Molti degli individui colpiti da XP hanno anche una varietà di sintomi non
correlati, compresi una progressiva degenerazione neurologica e deficit dello
sviluppo.
Lo XP deriva da difetti presenti in qualcuno dei sette prodotti genici che a 17
quanto pare sono coinvolti nella riparazione del DNA da danni UV.
SINDROME DI COCKAYNE ( CS )
Una rara malattia ereditaria associata anche a un meccanismo di
riparazione per eliminazione dei nucleotidi ( NER ) difettoso, dovuta ad
alterazioni di tre degli stessi geni coinvolti nello XP e di altri due.
Gli individui colpiti da CS sono ipersensibili alla luce UV e presentano
anche nanismo e disfunzioni neurologiche dovute a demienilizzazione,
ma tuttavia l’incidenza dei tumori cutanei cui sono soggetti, rientra nella
norma.
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Le DNA Glicosidasi rimuovono le basi alterate
Le basi danneggiate che non possono essere riparate direttamente sono rimosse
e sostituite nel corso di un processo noto col nome di riparazione per scissione delle
basi ( BER ).
I membri di questa classe di enzimi scindono il legame glicosidico di uno
specifico tipo di nucleotide alterato lasciando il residuo di desossiribosio nello
scheletro covalente.
Questi siti apurinici o apirimidinici ( AP o abasici ) sono generati anche in
condizioni fisiologiche normali per idrolisi spontanea di un legame glicosidico.
Il residuo di desossiribosio viene poi scisso
da una AP endonucleasi, e il residuo
desossiribosio viene rimosso insieme ad altri ad
opera dell’attività esonucleasica della DNA
polimerasi o da altre esonucleasi intracellulari.
L’interruzione che si forma viene riempita e
sigillata dalla DNA polimerasi e dalla DNA
ligasi.
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C. LA RISPOSTA SOS E LA RIPARAZIONE PER RICOMBINAZIONE
Gli agenti che danneggiano il DNA inducono in E. coli un complesso sistema
di modificazioni cellulari , note come risposta SOS.
Le cellula in cui si innesca la risposta SOS cessano di dividersi e aumentano
la loro capacità di riparare il DNA.
L’attività di questo sistema viene regolata da LexA, un repressore, e da
RecA una proteina che lega il DNA.
Durante la normale crescita, LexA reprime l’espressione del gene SOS
ma, quando il DNA è danneggiato le singole catene si legano a RecA, e il
complesso RecA-DNA promuove l’auto-inattivazione di LexA.
I geni SOS, che comprendono recA, lexA e anche i geni per la riparazione
per scissione uvrA e uvrB, vengono ora espressi.
Dopo la riparazione del DNA, il complesso RecA-DNA non è più presente e
quindi LexA di nuova sintesi, potrà reprimere l’espressione dei geni SOS.
20
La riparazione per ricombinazione ricorda la ricombinazione
genetica
La proteina RecA partecipa anche alla ricombinazione genetica.
Le cellule di E. coli con un gene RecA mutante sono deficitarie sia nella
ricombinazione genetica sia nella riparazione per ricombinazione, che viene
anche detta riparazione post-replicazione.
Questo sistema agisce quando il DNA danneggiato viene replicato prima
di essere riparato.
Il macchinario della replicazione si interrompe quando incontra il dimero di
pirimidina e riprende la polimerizzazione in qualche punto dopo il sito del dimero.
La catena figlia che viene prodotta presenta una interruzione in corrispondenza
del dimero di pirimidina
21
Questa lesione genetica non può
essere eliminata da una
riparazione per scissione, perché
sarebbe necessaria una catena
complementare intatta.
Una catena intatta è presente
nelle eliche duplex sorelle che si
formano alla stessa forcella di
replicazione.
La lesione può quindi essere
corretta scambiando i
corrispondenti segmenti di catene
di DNA sorelle.
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Il DNA è continuamente bersagliato all’interno delle
cellule da molti insulti di tipo ossidativo.
I danni di natura ossidativa aumentano con
l’invecchiamento e con le malattie degenerative ad esso
associate compreso il cancro.
Esistono 20 tipi diversi di modificazione ossidativa del
DNA. La più caratterizzata è la 8-ossi-2’deossiguanosina.
Durante la replicazione del DNA gli appaiamenti errati
tra questo nucleoside modificato contenuto nel
filamento stampo e i vari dNTP che devono essere
aggiunti al filamento in corso di sintesi, provocano,
delle transversioni da G a T che introducono mutazioni
nel DNA.
Nelle cellule dei polmoni l’inalazione di alcuni materiali
in forma particolata provoca l’aumento dei livelli di 8ossi-G. L’infiammazione associata a questo aumento,
può avere un ruolo nella formazione dei tumori al
polmone provocati dall’amianto.
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Interazioni DNA-PROTEINE
A. Endonucleasi di restrizione
B. Motivi di controllo trascrizionale nei procarioti
C. Fattori di trascrizione eucariotici
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INTERAZIONI DNA-PROTEINE
Per potere accedere alle informazioni genetiche è necessario che le
proteine siano in grado di riconoscere e di interagire con il DNA in maniera
che le infomazioni codificate possano essere copiate sotto forma di altro DNA
nella replicazione) oppure come RNA (nella trascrizione).
Molte proteine legano il DNA in modo non specifico, cioè senza alcun
riguardo alla sequenza dei nucleotidi. Per esempio, gli istoni e certe proteine
di replicazione del DNA (che devono potenzialmente interagire con tutte le
sequenze del genoma di un organismo) si legano al DNA attraverso
interazioni tra i gruppi funzionali delle proteine e lo scheletro zucchero
fosfato del DNA.
Le proteine che si legano a sequenze specifiche del DNA non disturbano
l’appaiamento delle basi del DNA duplex con cui interagiscono.
Esse sono ingrado di discriminare tra le quattro coppie di basi (A-T,
T-A, G-C e C-G) a seconda dei gruppi funzionali che le coppie di basi
proiettano nella scanalatura minore o maggiore del DNA.
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A. Endonucleasi di restrizione
Sono enzimi che eliminano dalle cellule batteriche il DNA estraneo,
rompendolo a livello di specifiche sequenze.
Gli enzimi infatti riconoscono sequenze palindromiche del DNA composte da
circa 4-8 coppie di basi con una tale specificità che la sostituzione di una sola
base determina una diminuzione della efficienza dell’enzima di un milione di
volte.
Questo grado di specificità
è necessario per impedire la
rottura accidentale del DNA
in altri siti.
Struttura ai raggi X della endonucleasi EcoRI complessata con il DNA
26
B. Motivi di controllo trascrizionale nei procarioti
Nei procarioti l’espressione di molti geni è regolata almeno in parte da
repressori di proteine che si legano ad un gene per impedirne la trascrizione.
Questi repressori contengono spesso segmenti che formano un motivo
elica-ripiegamento-elica (HTH)
Le sequenze a cui si lega il repressore è molto
simile a quella dell’operatore, cioè presenta una
simmetria palindromica.
La proteina repressore è un omodimero e
possiede
motivi HTH le cui eliche di riconoscimento si legano alle
scanalature maggiori successive del DNA bersaglio,
ciascuna in contatto con metà delle sequenze
dell’operatore.
Il repressore trp di E. coli controlla la trascrizione dei
gene necessari alla biosintesi del triptofano
Struttura ai raggi X di un complesso repressore trp-operatore di E.coli
27
C. Fattori di trascrizione eucariotici
Le proteine che legano il DNA negli eucarioti
utilizzano una grande varietà di motivi strutturali
diversi.
Un certo numero di proteine, note come fattori di
trascrizione innescano la trascrizione di geni legandosi
a sequenze di DNA su quei geni o vicino ad essi.
Il primo motivo che lega il DNA negli eucarioti, il dito
di zinco (zinc finger) fu scoperto da A. Klung nel
fattore di trascrizione III A (TFIIIA). Questo fattore
promuove la trascrizione della molecola ribosomiale
5S.
Il TFIIIA, una proteina di 344 residui, contiene nove
moduli simili di circa 30 residui ripetuti in coppie ognuno
delle quali ha due residui di His e due residui Cys tutti
invariati.
Ognuna di questa unità lega ioni zinco che si
uniscono con una configurazione tetraedrica ai residui
di His e di Cys.
Struttura NMR di un dito di zinco della proteina Xfin di Xenopus
28
Il dito di zinco Cys2-His2 contiene un foglietto β antiparallelo con due catena
e un’ α elica .
In un segmento di 72 residui della proteina di topo Zif268 vi sono tre di
questi motivi strutturali.
Le tre dita di zinco sono disposte come
domini separati in una struttura a forma
di C che si adatta nella scanalatura
Struttura ai raggi X di un segmento con tre dita di zinco della proteina
Zif268 in complesso con un DNA di 10 bp.
29
30
Rosalind Franklin
31
32
33
34
Watson e Crick
35
Tecnologia del DNA ricombinante
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L’ ibridazione è una strategia fondamentale nella tecnologia del DNA
ricombinante e rappresenta il processo attraverso il quale un frammento di
DNA o di RNA con sequenza nucleotidica nota e di dimensioni variabili (sonda
o probe) è utilizzato per identificare un altro frammento di DNA contenente
una sequenza complememntare (stampo o bersaglio).
Caratteristica essenziale per tutte le reazioni di ibridazione: sonda e stampo a
singolo filamento.
Il processo di separazione dei due filamenti di DNA è chiamato denaturazione o
melting, che avviene mediante l’aumento della temperatura o mediante il
trattamento con alcali ( quest’ultimo però idrolizza l’RNA)
37
Quando il DNA sonda e il DNA bersaglio a catena singola sono mescolati,
le basi complemantari tenderanno ad associarsi di nuovo.
Questo processo è chiamato riavvolgimento e può dare origine a diversi
prodotti a doppio filamento:
Un omoduplex sonda-sonda
Un omoduplex bersaglio-bersaglio
Eteroduplex ibridi sonda-bersaglio, bersaglio-sonda
38
L’affidabilità e la specificità del processo d’ibridazione e quindi la sua Tm
( melting point ) viene influenzata da vari fattori:
1. la lunghezza del filamento
2. la composizione in basi
3. forza ionica e pH della miscela di reazione
4. divergenza
5. presenza di denaturante
39
1)
Lunghezza. Quanto più lunga è la porzione a doppia elica, tanto
più alto è la Tm dell'ibrido.
2) Composizione
delle basi. Quanto più alta è la percentuale di
paia GC (unite da tre legami idrogeno) nella porzione a doppia elica
dell'ibrido, tanto maggiore è il numero dei legami idrogeno che lo
stabilizzano e, conseguentemente, tanto maggiore è la Tm.
Le coppie AT sono unite da due legami idrogeno.
40
3) Forza ionica e pH della miscela di reazione.
L’ibrido viene
destabilizzato sia a basse concentrazioni ioniche che a pH alcalino
(l'effetto è parzialmente dovuto al fatto che in queste condizioni i
gruppi fosfati degli acidi nucleici sono caricati negativamente e si
respingono fra di loro esercitando un effetto destabilizzante sulla
doppia elica).
Per questo motivo l'ibridazione viene eseguita ad alte concentrazioni
ioniche ed a pH neutro.
4) Divergenza. Quanto meno omologhe sono le catene, tanto minore è
il numero di legami idrogeno che stabilizzano l'ibrido e quindi la Tm.
41
5)
Presenza di denaturante. La presenza nella miscela di
reazione di alte concentrazioni di sodio favorisce la formazione di
DNA a doppia elica, mentre le sostanze che rompono i legami
idrogeno
nelle molecole di DNA, come l’urea o la formammide
(NH2-CH=O) stabilizzano il DNA a singolo filamento.
Molti protocolli prevedono l'uso di formmamide perchè permette
di lavorare a temperature di ibridazione più basse con i vantaggi
che questo comporta (meno degradazione termica del bersaglio e
della sonda, meno evaporazione, condizioni di lavoro più comode,
ecc.). La si può utilizzare soltanto per sonde che formino ibridi
maggiori di 40 bp.
42
Le sonde devono essere marcate per permetterne l’identificazione
(autoradiografia)
43
Esistono vari modi per marcare il DNA in vitro
1. Marcatura
terminale: consiste nell’attacco di un gruppo marcato ad
un’estremità della sonda.
Scambio del gruppo fosforico γ
marcato dell’ATP con il fosfato
sul terminale 5’ di un
frammento di DNA.
L’enzima che catalizza lo
scambio è la polinucleotide
chinasi.
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2. Marcatura mediante polimerasi:
Utilizzando una DNA polimerasi, numerosi nucleotidi marcati
possono essere incorporati in un sonda nel corso della sua sintesi.
Questa reazione di sintesi richiede naturalmente la presenza di
deossiribonucleotidi trifosfato (dNTP), di cui, in genere, uno, per
esempio il dCTP, è marcato (dCTP*).
Le sonde sintetizzate con questa tecnica hanno un’alta attività
specifica, poiché, mediamente fino al 25% dei nucleotidi incorporati
sono marcati.
45
Caratteristiche delle polimerasi α
La DNA polimerasi α presente solo nel nucleo delle cellule, partecipa
alla replicazione del DNA cromosomiale.
Questa proteina presenta multisubunità ( 4 in Drosophila; 5 nel fegato di
ratto) replica il DNA estendendo un primer nella direzione 5’
3’ sotto il
controllo di una singola catena di DNA che funziona da stampo.
La DNA polimerasi α è saldamente associata a una attività primasica, ma
manca dell’ attività esonucleasica.
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Caratteristiche delle polimerasi δ
La DNA polimerasi δ
è un enzima nucleare , manca dell’attività
primasica e possiede invece l’attività di lettura e correzione esonucleasica
3’ 5’.
La DNA polimerasi δ
ha capacità di incorporazione di nucleotidi
pressochè infinita e può replicare per intero, lo stampo che ha a
disposizione, ma soltanto quando è complessata con una proteina nota come
antigene nucleare delle cellule che proliferano PCNA.
Si ritiene che il complesso DNA polimerasi δ-PCNA sia la replicasi
della catena leader negli eucarioti (che richiede una elevata efficienza
d’ incorporazione e soltanto in qualche caso un primer ), mentre la
DNA polimerasi α sia la replicasi della catena ritardo (che richiede
invece frequenti primer ed ha un’efficienza di incorporazione di soli
100-200 nucleotidi).
47
Caratteristiche delle polimerasi ε
La polimerasi ε
che ricorda la DNA polimerasi δ, presenta un’elevata
efficienza di incorporazione di nucleotidi in assenza di PCNA.
Possiede un’attività esonucleasica 3’
5’ che degrada catene singole di
DNA a oligonucleotidi di sei o sette residui invece che a mononucleotidi,
come accade per la polimerasi δ.
E’ necessaria per la lesioni del DNA causate da luce UV, ma in vivo può
partecipare anche alla replicazione del DNA:
48
Caratteristiche delle polimerasi β
La polimerasi β è un enzima nucleare con dimensioni relativamente
piccole ( 335 residui nel ratto ) e la sua funzione biologica non è ancora
nota.
Caratteristiche delle polimerasi γ
La polimerasi γ è presente esclusivamente nei mitocondri, dove è
probabilmente coinvolta nella replicazione del genoma mitocondriale.
49
Una tecnica molto utilizzata per marcare un frammento
di DNA da utilizzare come sonda è costituita dalla
marcatura a innesco casuale ( random priming
).
50
Questa tecnica prevede l’utilizzo
Il frammento di
Klenow riempie
gli spazi vuoti
tra i vari
esanucleotidi e
sintetizza una
copia della
sonda
di diversi esanucleotidi con
sequenza casuale tale da
rappresentare tutte la possibili
combinazioni di basi A,T,G e C.
Necessariamente tra questi
esanucleotidi ce ne sarà almeno uno
in grado di ibridare con una regione
complementare su un filamento di
DNA.
La sonda che deve essere marcata
viene denaturata a DNA a singolo
filamento e incubata con la miscela di
esonucleotidi per permettere
l’ibridazione.
Il legame di uno o più esanucleotidi
a singolo filamento della sonda
genererà dei punti di innesco per
della DNA polimerasi (in paricolare si
userà il frammento di Klenow della
DNA polimerasi di E. coli ).
La DNA polimerasi I sintetizza il
DNA rimuovendo un nucleotide e
sostituendolo con uno nuovo presente
nell’ambiente circostante, con un
51
meccanismo simile al riparo.
IMMOBILIZZAZIONE DEL DNA
52
Il DNA può essere trasferito da gel semisolidi su membrane di nitrocellulosa
(processo descritto per la prima volta da Ed Southern).
Northern: tecnica di trasferimento su nitrocellulosa dell’RNA
Western: tecnica di trasferimento su nitrocellulosa di proteine
53
Oggi è possibile creare delle molecole ricombinanti tra segmenti di
DNA che non presentano omologia e che possono provenire da
organismi diversi.
Con l'utilizzo degli enzimi di restrizione e dei vettori molecolari è
possibile isolare una sequenza di DNA da qualsiasi organismo ed
inserirla nel DNA di un altro.
11
1111
Gli enzimi di restrizione sono indispensabili per effettuare un Southern blot.
1. Le endonucleasi di restrizione sono enzimi che idrolizzano i legami fosfodiesterici
su entrambi i filamenti di un DNA a doppia elica
2. sono altamente specifici per determinate sequenze di DNA e i siti su cui possono
agire (siti di riconoscimento o di restrizione) sono presenti sul DNA in modo
limitato.
55
I prodotti di digestione generati dall’incubazione
di una molecola di DNA con un enzima di restrizione
possono essere separati sulla base della loro
lunghezza mediante elettroforesi su gel.
L’elettroforesi su gel di agarosio permette di
separare frammenti di DNA di lunghezza variabile
da 100 basi a circa 20kb.
56
Piccole molecole di DNA possono migrare senza particolari ostacoli attraverso le
particelle di agarosio. Molecole più grandi, invece, si ripiegano su se stesse,
57
assumono complesse strutture tridimensionali e non riescono a migrare.
La velocità di migrazione dei frammenti di DNA dipenderà dalla loro dimensione
I frammenti di DNA
ottenuti mediante la
digestione con enzimi di
restrizione sono separati
sulla base delle loro
dimensioni attraverso
elettroforesi su gel di
agarosio.
Il gel viene poi immerso
in una soluzione alcalina
per denaturare il DNA.
I singoli filamenti così’
ottenuti possono passare
per osmosi attraverso il
gel e migrare su una
membrana di nylon, per
dare origine ad un archivio
di DNA digerito .
58
Southern Blotting
Il Southern blot individua frammenti di DNA bersaglio già
suddivisi in base alle dimensioni tramite elettroforesi su
gel di agarosio e permette:
di effettuare mappaggi di restrizione sia su DNA
genomico totale che su DNA ricombinante
di individuare mutazioni puntiformi: i polimorfismi dei
siti di restrizione (RFLP)
di individuare le delezioni o inserzioni geniche
responsabili di malattie genetiche
59
Southern Blotting
Nella tecnica Southern blot i frammenti di DNA
vengono trasferiti da un gel di agarosio ad una membrana
di nitrocellulosa o di nylon e vengono identificati tramite
ibridazione con una sonda marcata.
I frammenti di DNA a doppia elica, ottenuti per
trattamento con endonucleasi di restrizione, vengono
separati in base alla lunghezza per elettroforesi, ogni
frammento forma una banda che può essere visualizzata
colorando il gel con bromuro di etidio.
60
Dopo elettroforesi, i frammenti vengono trasferiti sulla membrana
per adsorbimento, adagiando quest’ultima sul gel e lasciando che il
tampone passi per capillarità, attraverso numerosi strati di carta
assorbente, trasportando il DNA dal gel alla membrana.
In questo passaggio il tampone denatura il DNA e trasferisce i
frammenti, ridotti a filamenti singoli, dal gel al foglio, immobilizzando
il DNA.
Una sonda marcata radioattivamente, la cui sequenza è
complementare al DNA bersaglio, viene utilizzata per l’ibridazione.
36
36
Southern Blotting
Southern Blotting
Le bande scure che si vedono sulla lastra autoradiografica sono
dovute al DNA ibridato alla sonda radioattiva.
37
Ibridazione su membrana: trasferimento secondo
Southern
AMPLIFICAZIONE E CLONAGGIO DEL DNA
L’amplificazione in vitro della quantità di DNA può essere
ottenuta con due metodi:
1.clonaggio del DNA basato su sistemi cellulari
2.clonaggio del DNA basato su sistemi enzimatici (cell-free)
64
Clonaggio basato su sistemi cellulari
Questa tecnica utilizza cellule batteriche.
I batteri contengono all’interno del loro citoplasma, in aggiunta al
loro cromosoma, una molecola di DNA circolare a doppia elica
extracromosomale (plasmide).
I plasmidi, a differenza del cromosoma batterico, vengono copiati
numerose volte durante ogni ciclo di replicazione cellulare: ideali
quindi per l’amplificazione di un frammento di DNA di interesse.
65
Caratteristiche dei vettori plasmidici:
-Origine di replicazione (ORI) del DNA
-Regione adatta ad inserire il DNA da clonare (sito multiplo di
clonaggio (MCS: Multiple Cloning Site, o poly-linker) che
contiene una serie di siti di taglio per gli enzimi di restrizione.
-Marcatori di selezione che permettono ai batteri trasformati di
crescere su terreno selettivo:
il gene della resistenza all’ampicillina, che codifica per
l’enzima ß-lattamasi che inattiva l’antibiotico.
Le cellule che hanno acquisito il plasmide possono essere selezionate
da quelle che non l’hanno acquisito, facendole crescere in un
terreno contenente ampicillina;
Plasmide ricombinante
DNA da clonare
Vettore
plasmidico
Trasformazione
nei batteri
Cellula
batterica non
trasformata
Moltiplicazione delle
cellule batteriche
Replicazione autonoma
del plasmide
Colonie di cellule che
contengono
copie dello stesso plasmide
ricombinante
(Endonucleasi di restrizione)
Il frammento clonato
può essere utilizzato
come sonda molecolare
oppure per varie
operazioni di ingegneria
genetica
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2. clonaggio del DNA basato su sistemi enzimatici (cell-free)
Clonaggio del DNA mediante PCR (polymerase chain reaction)
La reazione richiede i seguenti reagenti.
-un DNA stampo: il frammento di DNA che si vuole amplificare;
-i primers: piccoli oligonucleotidi che si legano ad una sequenza complementare
di basi all’inizio del frammento di DNA da amplificare
-la polimerasi
La PCR è una tecnica molto versatile che può essere utilizzata in numerose
metodiche di studio del DNA.
L’applicazione più frequente della PCR nella pratica clinica riguarda
l’identificazione di mutazioni genetiche mediante l’analisi del DNA amplificato,
in individui a rischio.
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La procedura denominata reazione a catena della polimerasi (PCR) può replicare
selettivamente e rapidamente una sequenza nucleotidica in grandi quantità.
Vengono disegnati degli oligonucleotidi (primers) complementari all'estremità 3'
del segmento di DNA da amplificare, che guidano la polimerasi sulla sequenza da
copiare.
La DNA polimerasi termoresistente è ottenuta dal Thermophilus aquaticus, un
batterio che vive nelle sorgenti di acque termali.
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21
Primo ciclo
Il DNA che si vuole amplificare (DNA bersaglio o
stampo) è scaldato a 94°C per permettere la completa
denaturazione.
La miscela è poi raffreddata e incubata con i primer
di oligonucleotidi che ibridizzano con le regioni
complementari sul DNA bersaglio.
La specificità è data dall’uso di due primer che
ibridizzano alle estremità delle sequenze dei due
opposti filamenti che contengono la sequenza da
amplificare.
In presenza di dNTP, l’ enzima Taq I polimerasi
catalizza l’allungamento del filamento di DNA
complementare al bersaglio aggiungendo nucleotidi
all’estremità 3’ del primer.
In questo modo si formano due nuove molecole di DNA
duplex, ognuna generata da ciascun primer sul proprio
stampo.
Cicli successivi
Nel secondo ciclo , i prodotti del primo ciclo
diventeranno stampi che contengono all’estremità 5’, i
primer usati come innesco
Da ora in poi, le molecole che possiedono le estremità
ben definite dai primer utilizzati si accumuleranno ciclo
dopo ciclo, fino a raggiungere un numero notevole al di
sopra delle molecole bersaglio iniziale.
Dopo 30 cicli il modello originale e i prodotti del
secondo ciclo saranno presenti nella miscela
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di reazione, ma il numero delle molecole
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amplificate sarà molto vicino a 10 .
E’ possibile che una mutazione crei o elimini un sito di restrizione: in questo caso le metodiche
basate su enzimi di restrizione permettono di dimostrare la presenza o l’assenza di un allele
mutato.
Una delle mutazioni più studiate è la sostituzione di A con T sul codone 6 del gene per le catene
β dell’emoglobina (β-globina), responsabile dell’ anemia falciforme.
Questa sostituzione determina la mutazione ac.glutammico-valina (Gln-Val) sulla proteina e la
scomparsa del sito di riconoscimento per l’enzima di restrizione MstII.
La digestione del DNA umano normale con MstII e l’analisi dopo Southern blot con una sonda
specifica per il promotore del gene della β dell’emoglobina permette di rilevare una singola base
di 1,2 kb, poiché il sito più vicino di riconosciuto da MstII si trova 1,2 kb a monte sulla regione
5’ del gene.
La scomparsa del sito di restrizione in seguito alla mutazione del codone 6, determina l’aumento
del frammento osservabile analizzando il DNA digerito con MstII, il quale sarà di 1,4 kb.
I pazienti affetti da anemia falciforme presenteranno solo una banda di 1,4 kb;
i portatori due bande, una di 1,2 kb e una di 1,4 kb, mentre gli individui sani avranno solo una
banda di 1,2 kb.
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73
Sono sequenze di DNA composte da pochi nucleotidi (tra uno e quattro)
che sono ripetuti in serie e in diverse posizioni all’nterno del genoma dei
mammiferi.
I MICROSATELLITI RAPPRESENTANO I MARCATORI IDEALI PER
LO STUDIO DELLA EREDITARIETÀ
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Diagnosi molecolare dalla Malattia di Huntington
La porzione del gene responsabile della Malattia di Huntington, che
comprende l’espansione delle triplette associata alla comparsa della
malattia, viene amplificata mediante PCR.
Ogni individuo possiede due copie del gene , una per ognuno dei
due cromosomi 4, e ogni reazione di PCR genera due prodotti.
I prodotti della PCR sono analizzati per elettroforesi e comparati con
la migrazione di una serie di frammenti a lunghezza nota per valutare
accuratamente la lunghezza dei prodotti di PCR e quindi il numero delle
triplette ripetute presenti.
I soggetti affetti dalla malattia presentano un numero di ripetizioni
superiori a 35.
La malattia di Huntington è trasmessa in modo autosomico
dominante quindi l’acquisizione anche di una singola copia del gene
mutato porta alla comparsa della malattia
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Blot per la diagnosi molecolare della malattia di Huntington con metodi
basati sulla PCR
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Basi molecolare della distrofia miotonica (MD)
La distrofia miotonica presenta il fenomeno dell’anticipazione
all’interno delle famiglie, cioè le caratteristiche cliniche della
malattia diventano sempre più gravi e compaiono in età sempre
più precoci a ogni generazione successiva.
Questa malattia è causata dalla presenza di una espansione
trinucleotidica instabile all’interno del gene MD, la quale si
allunga progressivamente a ogni meiosi.
Di conseguenza alle varie progenie vengono trasmesse
mutazioni più grandi, responsabili di un quadro clinico sempre
più aggravato e della tendenza a manifestare la condizione
patologica in età sempre più giovane.
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Il Southern blot qui riportato illustra l’aumento della dimensione
dell’espansione trinucleotidica nelle generazioni successive di una famiglia
affetta da MD.
La dimensione dell’allele normale è di 3,4 kb in un digerito con Bg/l e di 1,4 kb
in un digerito con Bam HI.
Con entrambi i metodi è possibile evidenziare come la lunghezza
dell’espansione trinucleotidica aumenti progressivamente generazione dopo
generazione.
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Elettroforesi delle proteine e
WESTERN blotting
Elettroforesi delle proteine
Una delle tecniche che meglio si adattano
ad una rapida valutazione dello stato di
purezza di una preparazione proteica è
l'elettroforesi su gel di poliacrilamide
(PAGE).
Le proteine migrano attraverso le maglie
del polimero, sotto l'effetto di un campo
elettrico, in base a tre caratteristiche:
-peso molecolare
-carica netta
-conformazione
ELETTROFORESI SU GEL
Circa 0.1-2 mg di
campione proteico sono
sciolte in un tampone TrisHCl 25 mM, pH 6,8,
contenente SDS 2% (w/v),
2-mercaptoetanolo 5%,
glicerolo 10%, e Blue di
bromofenolo 0,05% (w/v)
come marcatore colorato.
La solubilizzazione viene
completata bollendo il
campione a circa 100 °C
per pochi minuti. Le
proteine sono quindi
caricate nei pozzetti del gel
superiore.
L'apparato elettroforetico viene immerso in una soluzione elettrolitica contenente
Tris-HCl 25 mM, pH 8,6, Glicina 192 mM e SDS 0,1% (w/v). Infine l'elettroforesi
viene effettuata tra 100-200 V per circa 60 min.
Alla fine della
elettroforesi il gel viene
rimosso dalla lastra di
vetro e immerso in una
soluzione di Blue
Coomassie 0,25% (w/v)
in metanolo 50% e
60 kDa
acido acetico 10%.
Dopo circa 30 min di
incubazione il colorante
in eccesso viene
allontanato dal gel per
successivi lavaggi in
una soluzione di
metanolo 50% e acido
acetico 10%.
30 kDa
Colorazione del gel
M
1
2
3
4
5
Western blotting o immunoblotting di proteine
Uno dei metodi più efficaci per identificare una specifica proteina in
una miscela complessa con la specificità degli anticorpi e la
sensibilità dei dosaggi enzimatici.
Dopo l’elettroforesi sul gel le proteine vengono trasferite dal gel ad
una membrana di nitrocellulosa.
Western blotting
Elettrotrasferimento
Rivelazione colorimetrica
Sviluppo
La membrana viene incubata con una
soluzione di anticorpo specifico per la
proteina desiderata. Solo la banda
contenente questa proteina lega
l’anticorpo e dopo un tempo sufficiente
per far avvenire il legame, la membrana
viene lavata per rimuovere l’anticorpo
non legato.
La membrana viene poi incubata con un
secondo anticorpo che si lega
all’anticorpo già legato. Questo secondo
anticorpo è legato ad una fosfatasi
alcalina, che catalizza una reazione
quando viene aggiunto il substrato,
formando un precipitato color viola, che
marca la banda contenente la proteina
desiderata.
In presenza di perossido di
idrogeno la perossidasi di rafano
catalizza l’ossidazione del
luminolo producendo composti
intermedi stabili, che sono poi
convertiti in 3-amminoftalato e
conseguente emissione di luce.
La luce emessa
impressiona
l’emulsione di una
lastra radiografica.
Tecnologia Microarrays
I DNA microarrays sono una tecnologia che permette
di quantificare l’espressione degli mRNA simultaneamente.
I microarrays sono costituiti da macchie microscopiche
di sequenze di DNA, rappresentativi di migliaia di geni,
immobilizzate in posizioni strettamente ravvicinate sulla
superficie di un vetrino da microscopio.
Il DNA microarray è costituito da migliaia di
sequenze di DNA immobilizzate su un supporto,
presenti su una superficie miniaturizzata, per
l’ibridazione ad una sonda, preparata con RNA
estratto da una data linea cellulare o da un dato
tessuto.
I campioni di DNA sono preparati da cellule o
tessuti (per l’analisi del genotipo: campione di DNA
genomico), mentre per l’analisi di espressione:
campione di cDNA (DNA copia del pool di mRNA); in
alcuni protocolli si usa anche RNA derivanti da un
cDNA.
I campioni di DNA sono segnati con un marcatore radioattivo
o fluorescente. Nel punto sull’arrays, in cui il DNA immobilizzato
riconosce un DNA complementare, si verifica una ibridazione.
Il campione di DNA marcato identifica la posizione esatta
sull’arrays dove è avvenuta l’ibridazione, permettendo un
rilevamento automatico.
La quantità di cDNA complementare che si ibrida ad ogni
macchia sull’array viene misurata utilizzando un microscopio
confocale laser a scansione. I dati di ogni gene vengono inviati ad
un computer ed analizzati.
Supporti che vengono utilizzati per la costruzione dei microarrays:
-Arrays di cDNA su nylon
-Arrays di cDNA su vetro
-Arrays di oligonucleotidi su vetro
L’intensità di fluorescenza di un singolo gene è proporzionale
alla quantità di cDNA marcato che rimane attaccato al vetrino,
che a sua volta dipende dall’abbondanza del relativo mRNA
nel tessuto in esame.
Microarrays: applicazioni in Medicina
Le tecnologie di DNA arrays forniscono metodi rapidi per analizzare un
campione, al fine di identificare la presenza di variazioni o mutazioni di un
gene.
I microarrays dei geni umani che sono stati identificati sono stati
preparati per caratterizzare la loro espressione in organi e tessuti
differenti e in cellule tumorali.
L'analisi su scala genomica dei profili di espressione genica è molto
utilizzata nello studio dei meccanismi molecolari coinvolti nelle patologie e
nell'identificazione di nuove molecole di utilizzo farmaceutico.
La tecnologia dei microarrays potrebbe essere utilizzata per analizzare
le variazioni di espressione dell’intero genoma che avvengono durante il
differenziamento cellulare.
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Fine
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