Il microscopio elettronico a
scansione
Nel SEM (ed in genere nella
microscopia
elettronica)
viene sfruttata l’interazione
di un fascio di e- con il
campione
per
ricavare
informazioni sul campione
stesso come nel microscopio
luce a riflessione viene
utilizzato un fascio di fotoni
I campioni biologici devono subire diversi
processi prima di poter essere osservati al SEM.
Fissazione
Disidratazione
Doratura - cioè il ricoprimento del campione con
un sottilissimo strato d’oro ottenuto tramite
vapori
Questi trattamenti sono ben sopportati da
strutture abbastanza rigide e poco idratate mentre
rischiano di rovinare la morfologia di strutture
delicate.
Per ovviare a questo problema almeno in parte si
possono trattare i campioni con sostanze che li
induriscano e comunque trattarli con estrema
attenzione.
Il SEM è come una buona macro?
Il 3D della microscopia SEM è sufficiente per studiare organismi?
I “contro” della microscopia SEM:
Il campione deve subire una processazione lunga e invasiva
questo può modificare la struttura e non può essere fatto in vivo
Dopo la processazione sarà totalmente opaco agli elettroni e pertanto vedremo
solo la superficie esposta ma niente al di sotto.
gli oggetti appaiono in 3D ma solo per quello che concerne l’esterno
E’ possibile studiare oggetti tridimensionali con la microscopia ottica?
Molti campioni biologici sono trasparenti
quindi teoricamente è possibile osservare anche campioni spessi studiandone la struttura 3D.
Ma essendo trasparenti …
La fluorescenza
La fluorescenza è uno dei due processi radiativi con cui si può verificare il
rilassamento di una molecola eccitata, l'altro è la fosforescenza.
La luce eccita gli atomi della sostanza fluorescente, facendo saltare gli elettroni in
un'orbita più esterna. Subito dopo gli elettroni tornano al livello precedente
emettendo luce di lunghezza d’onda maggiore.
λA
λB
fluorocromo
λA< λB
Ogni fluorocromo è caratterizzato da :
SPETTRO DI ASSORBIMENTO
SPETTRO DI EMISSIONE
Questo significa che un
determinato fluorocromo
emetterà sempre nel suo
spettro di emissione, che
non cambia in funzione della
luce usata per eccitarlo.
Fluorescence filtering
Filtro di
eccitazione
Filtro di
emissione
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Due oggetti trasparenti:
quasi non li vedo
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
Vetrino
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Uno è colorato: lo vedo
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
Vetrino
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Oppure coloro l’altro:
lo vedo
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
Vetrino
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Li coloro entrambi.
Li vedo tutti e due male
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
Vetrino
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Li “coloro” con
sostanze
fluorescenti (con
diverso spettro di
assorbimento ed
eccitazione) ma
NON pigmentate
F = fluorocromo che emette verde
ma se non è eccitato è trasparente
F = Fluorocromo che emette rosso
ma se non è eccitato è trasparente
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
F
F
Vetrino
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Li “coloro” con
sostanze
fluorescenti (con
diverso spettro di
assorbimento ed
eccitazione) ma
NON pigmentate
Luce blu
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
F
Vetrino
Occorre un colorante che mi permetta di visualizzare certe strutture senza rendere opaco il
campione
La risposta a questa necessità parte dalla fluorescenza
Li “coloro” con
sostanze
fluorescenti (con
diverso spettro di
assorbimento ed
eccitazione) ma
NON pigmentate
Luce verde
Pochi
micron di
spessore
Campione
biologico
F
Vetrino
Ci sono comunque dei problemi:
• i tessuti biologi possono contenere sostanze fluorescenti
• gli oggetti non a fuoco danno comunque un po’ fastidio quindi comunque
è meglio per l’osservazione che il campione sia sottile.
Cioè questo non può funzionare:
Luce verde
Campione
biologico
Centinaia
micron di
spessore
Vetrino
La microscopia confocale
Confocal Laser Scanning Microscope
Occhio dell’osservatore
Lente oculare
Piano in cui si forma
l’immagine reale
Lente obiettivo
Campione
biologico
Vetrino
Occhio dell’osservatore
Lente oculare
Lente obiettivo
Campione
biologico
Vetrino
Occhio dell’osservatore
Lente oculare
Immagine reale formata
dall’obiettivo
Lente obiettivo
Campione
biologico
Vetrino
Occhio dell’osservatore
Lente oculare
Immagine reale formata
dall’obiettivo
Lente obiettivo
Campione
biologico
Vetrino
oculare
Immagine reale del piano a fuoco
obiettivo
campione
vetrino
oculare
Immagine reale del piano non a fuoco (sopra)
obiettivo
campione
vetrino
oculare
Immagine reale del piano non a fuoco (sotto)
obiettivo
campione
vetrino
oculare
pin hole
obiettivo
campione
vetrino
oculare
pin hole
obiettivo
campione
vetrino
oculare
pin hole
obiettivo
campione
vetrino
Ovviamente rendere invisibili i piani non a fuoco migliora la nitidezza delle
immagini.
Ma permette soprattutto di guardare all’interno di campioni TRASPARENTI
e MARCATI CON FLUOROCROMI, un piano alla volta
Si attua così quello che viene chiamato
SEZIONAMENTO OTTICO
SEM
I problemi della microscopia confocale a scansione laser:
1) la luce molto intensa del laser è citotossica (NO 4D)
2) la luce molto intensa del laser causa un veloce decadimento delle sostanze
fluorescenti
1) la luce con piccole lunghezze d’onda in genere necessarie ad eccitare i
fluorocromi non hanno un buon potere di penetrazione nei tessuti
MICROSCOPIA CON ECCITAZIONE A DUE FOTONI
Ad alcuni di questi problemi ovvia la microscopia a due fotoni (TPE
microscopy)
Se un fenomeno avviene grazie ad un fotone di lunghezza d’onda λ è
probabile che avvenga anche grazie a due fotoni di lunghezza 2λ (cioè con
metà energia).
Lunghezza d’onda maggiore = maggiore penetrazione in campioni spessi,
meno energia, meno danneggiamento del sistema biologico.
Super resolution microscopy
STED
STORM
etc
microtubuli
- Mitocondri -
Green Fluorescent Protein
Oltre alla proteina
responsabile della
chemioluminescenza blu
(Aequorina, 470 nm), venne
scoperta negli anni ‘60 una
proteina fluorescente con
emissione nel verde (508
nm).
Aequorea victoria
In vivo l’aequorina può
cedere la sua energia alla
GFP invece di emettere luce,
e la GFP emette luce verde.
La scoperta più importante fu che il gene, messo in un altro organismo, dava origine alla
GFP funzionante, dimostrando di avere in se tutte le informazioni per le modifiche posttraduzionali che la proteina subisce e non avere necessità di alcun enzima della medusa
La scoperta della GFP valse il
premio Nobel per la chimica
2008.
Tuttavia la storia comincia da
lontano quando Shimomura si
accorse di una proteina che si
accompagnava sempre alla
aequorina, nel 1962, e che
emetteva luce colorata se
sollecitata con altra luce
Mutazioni di un solo aminoacido possono causare cambiamenti negli spettri
Douglas Prasher fu il primo (nel
1987) a pensare che la proteina
potesse essere usata per “taggare”
altre proteine
Il “semplice” fatto di poter sapere quando e dove viene sintetizzata
una proteina, e poter vedere dove va in vivo, offre enormi
potenzialità.
Tuttavia possibilità ancora diverse si offrono se le proteine
fluorescenti possono essere ingegnerizzate e trasformate in sensori
per i più disparati parametri biologici.
