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2a ESPERIENZA DI LABORATORIO
Attraverso specifici coloranti potremo distinguere i batteri in gram positivi, ovvero i batteri
le cui cellule batteriche hanno i peptidoglicani (molecole della parete cellulare) in un unico
strato molto spesso, e in gram negativi, i batteri le cui cellule batteriche hanno lo strato di
peptidoglicani più sottile.
Sostanze utilizzate:
 crystal violet oxalate
 lugol’s iodine
 differantatior for kit gram-kuker
 safranina
Procedimento che abbiamo seguito:
1) Scrivere sul vetrino il nome della colonia da cui verranno prelevati i batteri e il nome
che si vuole dare a d esso.
2) Aggiungere una goccia d’acqua di rubinetto, infatti questa contenendo Sali non
altera la concentrazione osmotica delle cellule batteriche utilizzando la micropipetta
di precisione.
3) Sterilizzare l’ansa con il becco bulsen finché non diventa incandescente e
raffreddarla appoggiandola sull’agar.
4) Prelevare dalla coltura una parte dei batteri con l’ansa e strisciarla sul vetrino con
l’acqua.
5) Sterilizzare nuovamente l’ansa prima di riporla.
6) Fissare al calore il vetrino facendo passare il retro di esso per tre volte sul becco
bulsen. Questa operazione è necessaria per fissare i batteri sul vetrino e ucciderli.
Per tutti questi passaggi bisogna lavorare rigorosamente sotto cappa.
A questo punto possiamo procedere alla colorazione differenziata, che avviene con
quattro diverse sostanze citate in precedenza, ricordandoci di ricoprire la scritta del
vetrino con lo scotch.
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Primo colorante (crystal violetto), che colora le cellule batteriche e va tenuto per
60 secondi.
Mordente (soluzione di ioduro di potassio) che va tenuto 40 secondi, il quale
agisce come un fissante.
Decolorante (con una soluzione di etanolo) che va tenuto 30 secondi facendo
molta attenzione a non andare oltre il tempo fissato. Il decolorante distrugge i
lipidi causando l’eliminazione del primo colorante dalle cellule gram negative,
mentre quelle gram positive restano colorate di viola.
Contro- colorante (safronina) che agisce per 60 secondi. Ha un colore di
intensità minore del primo colorante e permetterà di riconoscere al microscopio
le cellule gram negative.
Tra un passaggio e l’altro bisogna sciacquare con l’acqua del rubinetto il vetrino e alla
fine di tutti i passaggi il vetrino va tamponato con un pezzo di tovagliolo e puiò essere
asciugato nel retro con questo. Dopodichè osserviamo al microscopio, prima
focalizziamo con 40x per avere una visione generale dei batteri e dopo a 100x per
avere una visione più particolareggiata.