Lezione_5

Secondo ordine
max
n 
 arcsin  
 a 
Monocromatore a prisma
•La dispersione (e la banda passante) non è costante con 
•Maggior risoluzione nell’UV
•Non ci sono effetti di secondo ordine
sin 1 n2

sin  2 n1
Filtri
Passa banda
Passa alto
Normalmente si usa un filtro passa-alto in emissione per eliminare ulteriormente la
luce di eccitazione diffusa.
Analogamente si può usare un filtro passa-banda in eccitazione per eliminare la “stray
light”
CUVETTE
• Normalmente in
quarzo (trasparente
nell’UV)
• Per la fluorescenza
tutte e quattro le
facce trasparenti
Fine intermezzo “strumentale”
Torniamo alle misure di fluorescenza
Osservabili: intensità
Dipende da:
Ecc.
•Concentrazione di fluoroforo
•Efficienza dell’assorbimento di radiazione (e)
•Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)

fotoni emessi
fotoni assorbiti
F  fotoni emessi = (fotoni assorbiti)   
per A' 1
 (I 0 ' I ')   (I 0 ' I 0 '10A ' )    (1 10A ' )
 d

 d

A
10A  10A A  0   (10 A ) A  1 A   e ln(10 )  
dA
A  0
dA
A  0
 d  A ln10 
A ln10
 1 A   e
 1 A   ln10 e

A  0  1 A  ln 10
dA
A 0

1 10A  A ln10
Em.
(1 10A' )  A'ln10

F    A   C e l
Filtro interno
Fluorescence (a.u.)
15
10
5
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Filtro interno
Ecc.
Ecc.
Campione diluito
Campione concentrato
50
A(  ecc. )  0.03 10

0.03
2
A ( ec c. )
2
 0.97
Fluorescence (a.u.)
F  I(centro cella )  I0 10

40
30
Measured
Inner-filter corrected
20
10
0
0
0.5
1
1.5
A
2
2.5
Filtro interno in emissione
Attenzione!
Assorbanza contro fluorescenza
Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no
•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)
•Sensibilità alla dinamica.
Intensità: applicazioni
• Misure di concentrazione
(fino a nM, ma anche singola molecola)
• Ambiente ed interazioni molecolari del
fluoroforo, tramite 
F   C e l
Partizione acqua membrana
Lipid
concentration
300
320
340
Wavelength (nm)
360
Apparent membrane-bound peptide fraction
Fluorescence intensity (a.u.)
KP
1
F10 1.1 M
F10 11 M
0.5
F10 30 M
0
0
0.001
Lipid (mM)
Stella et al., Biophys . J. 2004 86: 936–945.
Processi di associazione
Fluorescence (arbitrary units)
BSA bound
Free
400
450
500
 (nm)
550
600
pH
Altri esempi quando parleremo del
quenching
Osservabili: intensità e resa quantica
L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché
dipende anche da:
•Intensità della lampada
•Efficienza dei monocromatori
•Banda passante utilizzata
•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore
Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata
Al contrario,
•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]
•la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]
Osservabili: resa quantica
misura diretta
• Bisogna raccogliere i fotoni emessi in
tutte le direzioni
• Sfera integratrice
• Materiale altamente riflettente
(es. teflon)
• Alternativa: misura calorimetrica
Osservabili: resa quantica
misure per confronto
Fst
F   A
 st  S
Ast
F

F
A
S

F Ast
A

 
F
S
 st S Fst
A Fst
A
Ast
F Ast
   st

Fst A
Osservabili: resa quantica
misure per confronto
S dipende da exc e em:
standard e campione devono avere spettri simili.
Osservabili: resa quantica
misure per confronto
Se standard e campione sono in solventi differenti:
F Ast  n 
 
   st

Fst A  nst 
La frazione di luce
raccolta dal rivelatore
dipende dagli n
2
i
o
Angolo solido in coordinate sferiche

A
r2
L’intero angolo solido è 4
d 
dA
2

1
2
rd  r sin  d
r
r
d  sin dd
2


 
d sin d
0
0
A causa del diverso indice di rifrazione tra cuvetta ed esterno viene
rivelata una frazione della luce pari a
2
i
 d  sin d
i
2  sin d
i
d
i
 20
o
0
0
0
0
0
0
0
i2
 i 
2
 

 2   
o
o
o
o  o 
 d  sin d 2  sin d d 2
i
o
2
Legge di Snell
no sin i i


ni sin  o  o
2
2
i  i   no 
1
       2
o  o   ni  ni
F
2 F
  S  S'n
A
A
F Ast  n 
 
   st

Fst A  nst 
2
Indice di rifrazione a 500 nm
Aria:
1
Acqua:
1.337
Metanolo:
1.345
Etanolo:
1.365
Cicloesano: 1.431
N.B.:
dipendono da !
refractiveindex.info
Per acqua-cicloesano, il
fattore di correzione è
(1.431/1.337)2=1.14