Presentazione di PowerPoint - Corso di Laurea in Infermieristica

Anatomia e replicazione
del genoma
Le funzioni vitali della cellula dipendono dal ruolo svolto da tre
macromolecole biologiche:
1. DNA acido deossiribonucleico è il depositario dell’informazione
genetica. Ognuna di queste informazioni si trova contenuta sotto forma di
sequenza nucleotidica all’interno di un circoscritto segmento di DNA
denominato gene
L’insieme dei geni di una cellula, o organismo, viene chiamato, genoma
2. RNA acido ribonucleico (mRNA) sequenza nucleotidica che contiene le
informazioni necessarie per la sintesi di una proteina
3. Proteine polimero di amminoacidi uniti da legami peptidici. Le proteine
sono le macromolecole biologiche che compiono la maggior parte delle
funzioni cellulari (es. Elementi strutturali, catalizzano reazioni chimiche,
regolano l’espressione genica, fanno muovere e comunicare le cellule etc.).
Flusso dell’informazione genetica
Il corretto svolgimento delle attività
biologiche
cellulari
richiede
il
trasferimento dell’informazione genetica
da una macromolecola biologica ad
un’altra ad opera di tre diversi processi
biochimici:
Replicazione
Trascrizione
Traduzione
Espressione genica
Il linguaggio della sequenza nucleotidica
dei due acidi nucleici viene tradotto in
sequenza amminoacidica utilizzando un
codice che fa corrispondere ad una
tripletta nucleotidica presente nella
sequenza di un gene un amminoacido,
codice genetico
Tutti i diversi mRNA di una cellula
costituiscono il trascrittoma, l’insieme
delle diverse proteine, proteoma
La struttura del gene eucariotico: esoni ed introni
Sequenza discontinua, sequenza interrotta da regioni non codificanti di DNA introni.
Spliceosoma = complesso
ribonucleoproteico fatto da 150
proteine e 5 RNA detti small
nuclear RNA o snRNA, piccoli
RNA nucleari
Splicing alternativo può
produrre forme diverse di mRNA
e dunque di una proteina dallo
stesso gene
Perché i geni eucarioti hanno gli INTRONI?
1- consentono lo splicing alternativo: grande flessibilità e potenzialità nella
regolazione genica
2- in alcuni casi gli introni non vengono degradati e danno altri RNA funzionali
nella regolazione genica ovvero alcuni tipi di ncRNA (RNA non codificanti)
3- possibile ruolo evolutivo consentendo l’evoluzione di geni con esoni diversi
che codificherebbero per domini differenti della proteina. La ricombinazione
tra introni di geni diversi può avere creato geni con nuove combinazioni di
esoni: rimescolamento di esoni.
Dimensioni, contenuto e complessità dei genomi
La dimensione del genoma dell’uomo è influenzata da:
Esoni (1%)
Introni (24%)
DNA intergenico (75%)
Sequenze ripetute che derivano da errori
casuali che si verificano durante i processi
di replicazione e ricombinazione del DNA.
La dimensione di ogni genoma non sempre è correlata al grado evolutivo
dell’organismo che lo ospita
4 milioni di basi E.Coli
3,2 miliardi di basi uomo
Organismi più evoluti presentano un genoma più complesso
Organizzazione genetica del DNA altamente ripetitivo
satellite
minisatellite microsatellite
lunghezza dell'unità ripetitiva
150-200nt
<25nt
<5nt
lunghezza dei raggruppamenti
elevata
intermedia
contenuta
centromero
telomero
variabile
localizzazione
Aspetti generali sull’organizzazione fisica dei genomi
Il compartimento cellulare deputato a contenere il materiale genetico,
citoplasma per i procarioti, nucleo per gli eucaritoti, presenta
dimensioni di diversi ordini di grandezza inferiore alla lunghezza del
genoma ospitato
Il DNA subisce dei ripiegamenti, torsioni e
superavvolgimenti che gli fanno assumere la
conformazione di una massa filamentosa e
compatta
Assembl.
ribosomi
L’involucro nucleare
Livelli di organizzazione della cromatina eucariotica
Negli eucarioti il complesso che il DNA genomico forma con le proteine
responsabili della sua condensazione viene chiamato cromatina
In interfase:
Eucromatina
eterocromatina
interfase
mitosi
cromosomi
Corredo cromosomico umano
Un filamento
polinucleotidico
Un filamento di acido
nucleico è costituito da una
successione di quattro diversi
nucleotidi. Quindi c’è uno
scheletro zucchero-fosfato
costante e una sequenza di
basi variabile che costituisce
l’informazione
Struttura a doppia elica con i
filamenti orientati in modo
antiparallelo
Filamenti complementari
Struttura del DNA
Un gene è un tratto
di DNA in cui è
contenuta
l’informazione per
la sintesi di una
catena peptidica
Livelli di organizzazione della cromatina
Graduale processo di condensazione consiste in un progressivo aumento dello
spessore della fibra cromatinica ed a una riduzione della sua lunghezza
Livelli di organizzazione della cromatina
Fibra cromatina con aspetto nodulare dovuto alla
presenza di formazioni cilindriche chiamate
nucleosomi
Nucleosoma tratto di DNA avvolto attorno ad un
complesso multiproteico formato da proteine
basiche, istoni (H2A,H2B,H3,H4)
Livelli di organizzazione della cromatina
Fibra cromatinica che spiralizzando
forma una struttura elicoidale ad
andamento periodo.
Ogni spira è costituita da sei
nucleosomi
Istone H1 associa tra di loro due
nuleosomi confinanti all’interno della
stessa spira
Livelli di organizzazione della cromatina
interfase
formazione
di
anse
associate a proteine
della matrice nucleare
Cromosoma
disteso
mitosi
Impilamento delle anse e
successiva spiralizzazione
determina la formazione
del cromatide
Cromosoma
condensato
Il cromosoma
Telomeri:regioni che assicurano l’integrità del
cromosoma
La replicazione del DNA
La replicazione del DNA è una reazione biosintetica il cui risultato finale
consiste nella produzione di due copie identitiche di genoma sintetizzate a
partire da una unica e destinate a essere assegnate alle due cellule figlie
durante la divisione cellulare
-fenomeno biologico correlato con l’attività proliferativa della cellula
circoscritto alla fase S del ciclo cellulare
- è un processo semi-conservativo
-si svolge in modo simile in eucarioti e procarioti
Dal punto di vista molecolare la replicazione del DNA può essere suddivisa
in tre fasi denominate:
-Inizio
-Allungamento
-Terminazione
Complessi di modificazione della cromatina aggiunta di gruppi
chimici a specifici residui amminoacidici
1.acetilazione
2.Metilazione
Legame della metil-CpG binding protein alle “isole CpG” metilate che
recluta co-respressori e istone deacetilasi
Complessi di rimodellamento della cromatina
Esplicano i loro effetti utilizzando l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP
ATPasi SW1/SNF:
-attività rimodellante attraverso cui
all’ottamero istonico viene allentato
il
DNA avvolto
attorno
-Fa scorrere il DNA nucleosomico spostando sequenze di
regolazione trascrizionale verso zone maggiormente accessibili
-Dissocia un ottamero da un nucleosoma e lo associa a regioni
distinte di DNA
sono presenti anche enzimi che esercitano un’attività inibitoria sullo
stesso processo biologico
La replicazione del DNA è semiconservativa
Fase di inizio della replicazione: riconoscimento e
denaturazione dei siti di origine
1. Le proteine iniziatrici riconoscono e legano sequenze di DNA chiamate
“siti di origine” provocando al loro interno una distorsione della doppia
elica inducendo una denaturazione circoscritta
2. DNA elicasi ampliano la regione denaturata
3. Proteine che legano il DNA a singola catena impediscono alla sequenza
di DNA di rinaturarsi
4. Topoisomerasi enzima che rimuove i superavvolgimenti del DNA che si
formano ad azione dell’elicasi
Nei procaritoti è presente un unico sito di origine OriC
Negli eucarioti esistono siti multipli di replicazione presenti nelle varie
molecole di DNA che costituisco il genoma eucariotico
Bolla replicativa
Formata da due metà simmetriche
a forma di Y chiamate “forcine
replicative” le quali avanzano in
direzione opposta
Fase di allungamento sintesi di DNA
DNA polimerasi
-Legge lo stampo dal suo estremo 3’ verso quello 5’ mentre sintetizzano
il prodotto della reazione dal suo estremo 5’ verso quello 3’
-I nucleotidi trifosfato vengo aggiunti all’estremità 3’ del polinucleotide in
crescita e scelti affinchè contengano la base azotata complementare a
quella esposta sullo stampo
DNA polimerasi
-Necessita di un innesco per la sintesi del nuovo filamento di DNA
Le DNA polimerasi possiedono attività esonucleasica 3’-5’ che consente
loro di eliminare l’ultimo nucleotide 3’ del filamento in corso qualora questo
sia stato erroneamente incorporato, correzione di bozze
Fase di allungamento
sintesi bidirezionale di un filamento
complementare a quello parentale
Sintesi degli inneschi
DNA primasi nei procarioti(primer RNA)
DNA polimerasi a negli eucatioti (primer
RNA/DNA)
la replicazione richiede inneschi
multipli ed è discontinua
Una volta che gli inneschi sono stati
sintetizzati sul filamento 3’ viene
recluta la DNA polierasi III negli
eucarioti e la DNA polimerasi d nei
procarioti
FORCINA REPLICATIVA
DNA polimerasi
-Attività esonucleasica 3’-5’, correzione di bozze
-Core enzimatico responsabile dell’attività DNA polimerasica
-Fattore di assemblaggio
-Morsa scorrevole, struttura ad anello che avvolge il filamento
stampo e scorre su di esso
-Caricatore della morsa sul DNA a livello della giunzione innescostampo
-Nei procarioti: Dimero che assembla insieme i due core enzimatici
impegnati nella sintesi formando un dimero di DNA polimerasi
-Negli eucarioti:funziona come monomero, sul filamento guida e su
quello tardivo operano due distinti apparati replicativi
La natura antiparallela della doppia elica crea una complicazione per la replicazione simultanea dei due filamenti. Poiché il
DNA è sintetizzato aggiungendo nucleotidi in direzione 5’3’, soltanto uno dei due filamenti stampo può essere replicato in
modo continuo seguendo la direzione della forcella di replicazione. Il DNA neosintetizzato a partire da questo stampo prende
il nome di filamento continuo (leading strand). La replicazione dell’altro filamento è più problematica, in quanto la DNA
polimerasi III deve muoversi in direzione opposta rispetto a quella della forcella di replicazione. Il filamento di DNA
neosintetizzato da questo stampo è conosciuto come filamento ritardato (lagging strand) e la sintesi avviene in maniera
discontinua, mediante la formazione dei frammenti di Okazaki.
Fase di terminazione
La fase dell’allungamento si conclude quando viene portata a
completamento la polimerizzazione dei filamenti neo sintetizzati
Rimozione degli inneschi e risintesi di DNA
-nei procarioti reclutamento di DNA polimerasi I con attività
esonucleasica 5’-3’ e polimerasica (sostituzione delle polierasi)
- negli eucarioti viene reclutato l’enzima FEN1 che insieme a DNA
elicasi e ribonuleasi H rimuove l’innesco, la DNA polimerasi d
risintetizza la regione dell’innesco
La DNA ligasi forma un legame fosfodiesterico fra i frammenti di DNA
formati
Si ritiene che la terminazione della replicazione del DNA avvenga quando
due forcine replicative che procedono in direzione opposta si incontrano.
Il contatto provoca il distacco dei due apparati replicativi e le due estremità
neo-sintetizzate vengono unite dalla DNA ligasi
.
DNA telomerico
I telomeri rappresentano le estremità dei cromosomi lineari. Sono
costituiti da una regione a doppio filamento e da una porzione a
singolo filamento. Il DNA telomerico presenta ripetizioni in tandem di
sequenze nucleotidiche.
Le sequenze ripetute in tandem alle estremità dei cromosomi sono specie
specifiche. Nell’uomo, come in tutti i vertebrati, la sequenza è 5’-T2AG3-3’. La
tabella, inoltre, mostra che la lunghezza dei telomeri è diversa nelle varie specie,
nell’uomo è di 5-15kb.
LUNGHEZZA
SEQUENZA
TELOMERO
TELOMERO
120-140 bp
T 2G 4
200-300 bp
TG2-3(TG)11-6
Uomo
5-15 kb
T2AG3
Topo
Oltre 150 kb
T2AG3
Ratto
20-100 kb
T2AG3
Uccello
5-20 kb
T2AG3
9-13 kb
T2AG2
2-5 kb
T3AG3
SPECIE
Ciliati
T. thermophila
Lieviti
S. cerevisiae
Vertebrati
Invertebrati
Formica
Piante
A. thaliana
L’erosione dei telomeri: “end replication problem”
I telomeri perdono approssimativamente 50200 bp per ogni divisione cellulare a causa
del cosiddetto “end replication problem”. il
meccanismo di replicazione del DNA non è
in grado di replicare completamente le
estremità dei cromosomi lineari, con
conseguente erosione dei telomeri
L’enzima telomerasi promuove un
allungamento compensatorio dei telomeri
Per la replicazione del DNA è necessaria la sintesi di frammenti di RNA
utilizzati come inneschi. La necessità di avere inneschi a RNA crea un
problema per la replicazione delle parti terminali dei cromosomi lineari.
Infatti, una volta rimosso l’ultimo innesco all’estremità 5’ del filamento
ritardato e del filamento veloce, non è più possibile replicare l’estremità 3’
dello stampo. Di conseguenza, si formano estremità ssDNA al 3’, di
grandezza pari a quella dell’innesco rimosso. Questo meccanismo
porterebbe alla perdita di materiale genetico di generazione in
generazione.
La telomerasi
La telomerasi è una ribonucleoproteina composta di due parti essenziali: una
componente catalitica , trascrittasi inversa, che catalizza la sintesi di porzioni
di DNA complementari alla molecola di RNA contenuta all’interno del suo sito
catalitico e che, pertanto, funge da stampo e una molecola di RNA
complementare al filamento 3’ protusivo
Meccanismo d’azione della telomerasi
a) il DNA telomerico è riconosciuto
dalla telomerasi, l’estremità 3’ del
DNA forma un ibrido con l’RNA
stampo della telomerasi
b) la telomerasi catalizza l’aggiunta
di nucleotidi all’estremità 3’,
usando come stampo l’RNA.
c) la telomerasi trasloca
d) determina l’aggiunta di ulteriori
nucleotidi all’estremità 3’. Dopo un
determinato numero di cicli, la
primasi sintetizza un innesco ad
RNA utilizzando come stampo
l’estremità 3’. La DNA polimerasi I
catalizzerà l’aggiunta di nucleotidi
e, quindi, la replicazione del tratto
neo-sintetizzato dalla telomerasi
(Autexier e Lue, 2006).