Lez_3_4_BioApp_8-3

Lezione 2-3
8-3-07
Cosa si deve sapere
Enrico Alberto
d’Albertis guardia
marina di I classe
al timone del
Corsaro
Siamo arrivati tardi,
allora le scienze
naturali si studiavano
così
E.d’A. fece il periplo
dell’Africa e tre volte il
giro del mondo (non
in barca),
A noi tocca stare solo
in laboratorio
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Come si faceva scienza
Il capitano E.d’Albertis col Corsaro sullo Skagerrak
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Dove era andato a finire
di ritorno da Santo
Domingo dopo la
traversata per il IV
cenenario della
transatlantica di
C.Colombo
Misurava la
grandezza dei
ghiacciai, è stato il
primo a segnare i
margini del
ghiacciaio del Gran
Paradiso per
studiare l’escursione
e l’adattamento
delle specie
biologiche
Cosa si deve sapere
Adesso!
La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5’-3’, DNA pol
i cromatidi da cosa sono costituiti ?
quale è il verso di trascrizione della RNA pol II
“coding strand”* = filamento trascritto = mRNA
* non è il templato
cDNA (DNA complementare al messaggero)
c non vuol dire coding
da distinguere dalla Coding Sequence a volte confusa col cDNA
La sequenza codificante corrisponde all’ RNA messaggero
contiene i codoni che vengono tradotti
Trascrizione e complemetarietà
definizione equivoca
In banca dati la sequenza di un gene è indicata nel verso
di trascrizione e corrisponde alla coding sequence
che è uguale al messaggero (salvo T
U).
Le sequenze per convenzione si scricvono sempre in
orientamento 5’-3’ salvo quando si mostra una doppia elica
in cui c’è la complementare che è antiparallela
Trascrizione orientamento e verso
La sequenza “coding” non è il templato
templato
corretto
S
B
A
G
L
I
A
T
O
Quale strand è trascritto? che
verso ha ?
Rna polimerasi II
DNA templato della trascrizione
Tutte le pol sintetizzano 5’-3’ su un templato 3’- 5’ antiparallelo
mRNA
schema giusto
Cosa è un Southern blot
DNA digerito con enzimi di restrizione
- trasferito su filtro
- Ibridato con una sonda marcata di DNA a doppio filamento
denaturato o con singolo filamento
Studio di mappe di restrizione genomiche per individuare i
frammenti di restrizione che contengono una data porzione di
DNA o un frammento di un gene,
Studio di un gene sul genoma a partire da un cDNA usato
come sonda
Quando è utile l’analisi Southern
Mappa fisica di restrizione di DNA genomico
Per individuare frammenti di restrizione da poter clonare
Per trovare i frammenti di restrizione da subclonare da un
clone genomico
Per analisi di buona esecuzione di un clonaggio
Per trovare: geni omologhi in altre specie
geni duplicati nel genoma
famiglie di geni con regioni conservate
Per analisi di polimorfismi
Southern blot
Southern technique
Gel BrEt x Southern
Foto Southern
A: Genomic P1 clone (0.3 ug) and B: human genomic DNA (10 ug) were digested with EcoRI (E),
BamHI (B), HindIII (H) and PstI (P). The digested samples were separated on a 1% agarose TBE
gel, blotted and hybridized with a PEDF cDNA probe. A 1 kb ladder is given to show relative sizes
of the hybridizing bands. The figure shows similarities in restriction pattern between the genomic
DNA and the P1 clone.
genomico
clone P1
Southern analysis
Controllo positivo del probe nella corsia 10
In corsia 6 sito polimorfico taglia il frg 4 kb in 2 pezzi
Quando si usa l’analisi
Northern
Per studiare l’espressione (trascrizione) di un gene
Per trovare il peso di un trascritto di un gene, splicing
alternativi, diversi siti di inizio o fine trascrizione UTR
Per confrontare il livello di trascrizione
Come si normalizza, cosa vuol dire
Geni house keeping: B actina, prot ribosomiali, GAPDH ecc.
Quantità uguali di RNA - quantità uguali di cellule
La tecnica Northern
(Non è un’analisi di restrizione o di mappa)
Stabilità di RNA e mRNA singola elica
degradabilità
Efficienza delle RNAsi
Turn over, differenze DNA-RNA
Stabilità della doppia elica del DNA
Accortezze contro la degradazione, resistenza delle RNAsi
Elettroforesi, blotting (trasferimento), ibridazione, lavaggi,
rilevamento (radioat. fluorescenza) comune al Southern
Northern
Analisi della espressione della Fosfodiesterasi tipo 8A
(non si vede la normalizzazione)
Northern nomalizzato
Callo osseo, osso sano, Adrenal, Brain, Eye, Hind-brain, Liver, Lung, Parotide, Sk
muscle, Spleen, Stomach, Tendon, Testes, Thymus, Thyroid, Trachea
MUSTANG stands for MUsculoSkeletal Transcriptionaly Activated Novel Gene.
The work on this gene began with the discovery of an EST that was substantially
up-regulated in RNA samples isolated from rat fracture callus. The original EST
was used to compile a CONTIG that contained a hypothetical ORF flanked by 5'
and 3' UTRs and also containing a poly-adenylation site. Using this CONTIG as
a reference, RT-PCR was performed to create a cDNA clone which was then
subcloned into a plasmid and sequenced. The sequence matched the CONTIG
perfectly and an subsequent bioinformatic analysis of the predicted AA
sequence identified a nuclear import signal.
Cosa è un clone EST
EST Expressed Site Tag
Banche dati di cloni derivati dal trascrittoma di cellule o
tessuti di organismi in fasi diverse di crescita o sviluppo
db EST è la banca dati di cloni di cDNA non interi divisi per
organismi. Sono i tags di tutti i trascritti possibili.
Dal sito NCBI si trova il link
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/index.html
Si deve andare su Blast nucleotide blast-n
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Mettere la sequenza o come n.di Gene Bank o come
nucleotidi, selezionare EST su barra “choose database”
Fusion protein GFP
Nuclear localization of MUSTANG-GFP. MC3T3 cells were transiently transfected with the
MUSTANG-GFP plasmid and the parental pEGFP-C1 vector. Images were obtained under
phase contrast and epi-fluorescence confocal microscopy (600X). Phase contrast images of
cells transfected with (A) MUSTANG-GFP and (B) pEGFP-C1. Seen under epifluorescence, (C) MUSTANG-GFP localizes to the nucleus, whereas the vector (D) EGFP is
evenly dispersed throughout the cell. Overlaid images of the phase and fluorescence
images clarify the nuclear localization of (E) MUSATANG-GFP compared to the broad
dispersal of (E) EGFP.
Analisi di trascritti sui polisomi
Differenze tra RNA nucleare e citoplasmatico
Analisi di complessi polisomici (traduzione)
Cosa si analizza con un
Northern blot
La trascrizione cellulare
Foto Northern (lattato deidrogenasi)
Le sonde (probes)
Sonde a DNA doppio o singolo filamento anche ad RNA**
Plasmidi con promotore di trascrizione Sp6**
Sonde clonate o amplificate
Sonde marcate (32 P) o fluorescenti
Southern o Northern tipi di sonde uguali
Su Southern sono presenti entrambe i filamenti
Su Northern c’è solo il filamento trascritto
(ibrida un solo filamento)
Dall’espressione al genoma
e viceversa
Con le sonde dei cDNA
al genoma
(analisi della mappa fisica e regioni non trascritte)
Con le sonde genomiche
ricerca di geni
e analisi genomiche
Uso dei marcatori
Ricerche di tutte le sequenze trascritte come marcatori
Da sequenze ripetute mappature cromosomiche
Introduzione di SNP come marcatori
Struttura e regolazione dei geni
Perché i geni sono regolati
Meccanismi di regolazione dei geni
Differenze tra procarioti ed eucarioti (cistroni,operoni)
Differenti strutture regolative analizzate con geni reporter e
utilizzate all’interno di plasmidi
e vettori per espressione
Dovete sapere come è strutturato un gene, differenze tra
procarioti ed eucarioti, geni costitutivi e “house keeping”,
geni inducibili, regolati e tessuto specifici. (corso di bio molec.)
Che vuol dire clonare a che
serve come si fa
I cloni in microbiologia o genetica dei microoranismi
I colonia (clone) deriva dalle mitosi di una singola cellula
e contiene almeno qualche centinaio di migliaia di cellule
Cloni di cellule eucariotiche
Esperimenti olistici
(≠ progr. euristici autoincr.)
Phenotypic alteration of eukaryotic cells using
randomized libraries of artificial transcription factors
Nature Biotechnology 21, 1208 - 1214 (2003)
Published online: 7 September 2003; | doi:10.1038/nbt868
Kyung-Soon Park1, 2, Dong-ki Lee1, 2, Horim Lee1, Yangsoon Lee1, Young-Soon Jang1,
Yong Ha Kim1, Hyo-Young Yang1, Sung-Il Lee1, Wongi Seol1 & Jin-Soo Kim1
Correspondence should be addressed to Jin-Soo Kim [email protected]
We have developed a method in which randomized libraries of zinc
finger−containing artificial transcription factors are used to induce phenotypic
variations in yeast and mammalian cells. By linking multiple zinc-finger domains
together, we constructed more than 100,000 zinc-finger proteins with diverse DNAbinding specificities and fused each of them to either a transcription activation or
repression domain. The resulting transcriptional regulatory proteins were
expressed individually in cells, and the transfected cells were screened for various
phenotypic changes, such as drug resistance, thermotolerance or osmotolerance in
yeast, and differentiation in mammalian cells. Genes associated with the selected
phenotypes were also identified. Our results show that randomized libraries of
artificial transcription factors are useful tools for functional genomics and
phenotypic engineering.
Esperimento olistico (italiano)
Traduzione dell’abstract Nature Biotech 2003
Abbiamo sviluppato un metodo col quale librerie di fattori di trascrizione “zinkfinger” artificiali sono usati per indurre varianti fenotipiche in lievito e cellule di
mammifero. Legando domini “zink-finger” insieme, abbiamo costruito più di
100'000 proteine “zink-finger” con diverse specificità di legame al DNA e
ciascuna fusa a domini di attivazione o repressione della trascrizione. Le
risultanti proteine regolatrici di trascrizione erano espresse individualmente in
cellule e le cellule trasfettate venivano selezionate per i cambiamenti
fenotipici come : resistenza a sost.chimiche, termotolleranza, tolleranza
osmotica in lievito e differenziamento in cellule di mammifero. I geni associati
con i fenotipi selezionati vengono identificati (CHIP chromosome immuneprecipitation).
I nostri risultati mostrano che le librerie randomizzate di fattori di trascrizione
sono uno strumento utile per studi di genomica funzionale e ingegneria
fenotipica.
Clonaggio come manipolazione di
DNA
Clonaggio : plasmidi
enzimi di restrizione
Clonaggio perché i cloni sono isogenici e se contengono un
plasmide si moltiplica con le cellule
Le cellule trasfettate col plasmide si clonano
Strategia e metodo di clonaggio
Extraction of Viral RNA and
Conversion to DNA
Reverse Transcription
RNA
DNA
Cloning a Gene into a Plasmid
Amplificazione tramite PCR
PCR
clonaggio
Cloning
Gene
codificante
DNA
encoding
di interesse
gene of interest
pl di
plasmid
Plasmide
espressione
Growth and Purification of
Plasmids
trasfezione
Transfection
estrazione del DNA
Extraction
crescita batterica
col plasmide
Plasmid growth
tramite selezione
in bacteria
Purification of
Purificazione
plasmid
del
plasmide
Recombinant DNA Technology and
Vaccine Development
produzione dell’antigene
In vitro
In
vitro antigen
production
Cellule
eucariotiche
CHO, yeast,
or insect cells
vettore
col vaccino
Vaccine vector
Trasfezione diretta
o con vettore virale
Produzione
dell’antigene in
In vivo
vivo antigen
production
Trasformazione: veicolazione del
DNA nelle cellule
Nei batteri : Ca Cl2, shock termico, elettroporazione,fagi
Nelle cellule eucariotiche animali # vegetali (parete di cellulosa)
- elettroporazione, pseudo-membrane sintetiche, virus
(Lo stesso problema esiste per la terapia genica somatica)
Vantaggi e svantaggi delle varie tecniche
Più complesso trasformare le cellule eucariotiche