Glucosio endogeno
gluconeogenesi
Glucosio esogeno
glicogenolisi
assorbimento dei
carboidrati del pasto
Glucosio
plasmatico
utilizzazione periferica
eliminazione renale
Principali effetti della insulina
muscolo
tessuto adiposo
Insulina
• Aumento trasporto ed
utilizzazione del glucosio
• Aumento trasporto ed
utilizzazione del glucosio
• Immagazzinamento dei grassi
• Riduzione della liberazione dei
grassi
fegato
•Aumento della utilizzazione del glucosio
•Riduzione del rilascio di glucosio
100 grammi
Curva risposta livelli
insulina
Metodi determinazione Glucosio
• Metodi che sfruttano il potere riducente del
glucosio (acido picrico,ioni rameici,
ferricianuro,acido 3,5 dinitrosalicilico)
• Metodo dell’ o-toluidina
• Metodi enzimatici:
• Glucosio ossidasi
• Esochinasi
• Uso di un elettrodo a ossigeno
Spettro visibile
390
UV
450
Wavelength (nm)
520
590
620
Increasing Energy
Increasing Wavelength
“Red-Orange-Yellow-Green-Blue”
780
IR
H
+ Ac.Carbossilico
+ Aldeide
Riscaldamento 90° 5-15
min, colore a 540-575nm
Acido 3,5-dinitrosalicilico
NH2
+ Ac.Carbossilico
+ Aldeide
Ac.picrico
Col.giallo
Ac.picramico
Col.rosso
Fe(CN)6K4
Fe(CN)6K3
giallo
ferrocianuro
2Cu 2+
+ Aldeide
Cu+
+ Neocuproina
2,9-dimetil-1,10-fenantrolina
Lettura 410 nm
incolore
Cu+ + Ac.carbossilico
Lettura 454
Cu+
Glucosio +H2O -------(glucosio ossidasi)-------- Glucolattone +H2O2
H2O2 + Cromogeno (ridotto) in presenza di perossidasi
H2O + Cromogeno ox
O-CH3
CH3
Cromogeni utilizzati: o-anisidina
o-toluidina
abbandonati perché cancerogeni
4-aminoantipirina
glicosamina
perossidasi
4-aminoantipirina
fenolo
Chinonimina
Chinonimina
lettura a 480-520
NADP+
NADPH+H+
Rappresentazione schematica
di un biosensore ad O2
BIOSENSORI ELETTROCHIMICI AMPEROMETRICI
O-ring
Membrana enzimatica
Elettrodo di
Supporto lavoro di Pt
Membrana di
policarbonato
Membrana di acetato
di cellulosa
Elettrodo di
riferimento (Ag/AgCl)
Elettrodo ad ossigeno
Un comune elettrodo ad ossigeno è l’elettrodo di Clark:
catodo (elettrodo di lavoro) di platino o d’oro,
anodo (elettrodo di riferimento) di Ag/AgCl,
separati da una resina epossidica isolata.
I due elettrodi sono fissati in un supporto di plastica contenente una
soluzione elettrolitica.
Il tutto è separato dalla soluzione esterna, in cui verrà addizionato il
campione da misurare, da una membrana gas permeabile (membrana di
teflon). L’elettrodo di lavoro è mantenuto ad un potenziale di circa -700
mV rispetto all’elettrodo d’argento ed è posto in intimo contatto con la
membrana a gas al fine di ottenere una risposta rapida. In queste
condizioni si registra una variazione di corrente dovuta alla riduzione
dell’ossigeno al catodo secondo la seguente reazione:
Pt= catodo
O2 + 4H++ 4e- 2 H2O
mentre all’anodo Ag/AgCl
4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-
Elettrodo ad ossigeno
Il sensore ad O2 può essere accoppiato con un grande numero di enzimi
ossidasi immobilizzati su opportune membrane polimeriche che vengono
sovrapposte alla membrana di teflon. Come esempio riportiamo il classico
sensore sviluppato da Clark e Lyons nel 1962 con l’enzima glucosio ossidasi
che catalizza la seguente reazione in due passaggi:
Glucosio + Enzima-FAD + H2O acido gluconico + Enzima-FADH2
Enzima-FADH2 + O2 H2O2 + Enzima-FAD
La corrente dovuta alla riduzione dell’ossigeno al catodo diminuisce
all’aumentare della concetrazione di glucosio in soluzione. Se l’analita da
misurare non è substrato di un’ossidasi è possibile utilizzare, in alcuni casi,
una sequenza enzimatica che, partendo dall’analita, generi un composto che
è substrato di una ossidasi.
Sensore ad H2O2
La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata
per la determinazione del glucosio monitorando la produzione di H2O2 con
un sensore specifico per quest’ultima specie. Questo sensore
amperometrico ha la stessa configurazione di quello ad ossigeno, in questo
caso però la polarità è invertita, + 650 mV, e l’elettrodo di lavoro di
platino funziona da anodo, mentre l’elettrodo di riferimento di Ag/AgCl
funziona da catodo. La reazione di ossidazione dell’acqua ossigenata
all’anodo è la seguente:
H2O2 O2 +2H+ +2eLa membrana gas permeabile dell’elettrodo ad O2 viene sostituita con una
membrana di acetato di cellulosa che impedisce il passaggio di composti con
peso molecolare superiore a 100-150 dalton che potrebbero essere
elettroattivi o potrebbero avvelenare gli elettrodi.
L’enzima è immobilizzato e tenuto il piu’ vicino possibile all’elettrodo di
lavoro, quindi l’H2O2 che si produce dalla reazione enzimatica diffonde
attraverso la barriera di acetato di cellulosa, raggiunge l’elettrodo di
lavoro e produce un aumento di corrente che è direttamente proporzionale
alla concentrazione dell’analita da analizzare.
Volume del campione si passa da 30 to 0.3 μl.
Tempi da 2 min a 5 sec
Riflettanza localizzata
temperatura-mediata
Si basa
sull'osservazione che variazioni di temperatura pro
vocano variazioni dell’ indice di
rifrazione dei tessuti (che influenza la dispersion
e della luce), ma l'entità di questi
cambiamenti dipende anche dalla concentrazione
di glucosio [73], la quale è stimata con i
segnali di riflettanza localizzati a 590 e 935 nm.
Altri test diagnostici
•
•
•
•
Insulina
Emoglobina glicosilata
Autoanticorpi
Corpi chetonici
RIA=tracciante radioattivo
EIA=tracciante enzimatico
HbAo
Hb glicata
HbA1c
HbA3
HbF
HbA1a+b
a-chain
uso di un anticorpo secondario
La procedura implica l’uso di un anticorpo secondario marcato, in grado di
riconoscere la regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente incubato su
fase solida.
La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in
soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dell’anticorpo
presente in concentrazione fissa.
La misura del prodotto enzimatico sarà direttamente proporzionale nel caso della
misura del titolo dell’anticorpo da determinare, mentre inversamente proporzionale
per l’analita.
I corpi chetonici si possono testare con strisce
reattive
• Il reagente è il
nitroprussato di sodio
• Reagisce con acido
acetoacetico e con
acetone, mnon con
beta-OH-butirrato
• Colorazione viola
• Range: 5-160 mg/dl
