Il frazionamento della dose

Tumor growth




Tumor is characterised by
uncontrolled cell duplication
Tumor is clinically detectable
when weights around 1 g about
109 cells
The tumor damages mechanically
surrounding healthy tissue and
organs
Tumor growth is described by its
doubling time (volume)
Tumor growth and
neovascularisation


The growth of tumor is associated to
formation of blood vessels needed
for oxygen and food
(neoangiogenesis)
Rapidly growing tumors could have
slower angiogenesis that leads to
necrotic and hypoxic regions into
tumors
Tumor growth: after RT, CT and
OT


Tumor growth is stopped due to tumor’s cells
death
Tumor volume diminuishes slowly because
death cells are evacuated slowly
Local control


“All” tumor’s cell are destroyed
Immunitary killing of few survival cells
Growth delay




Proliferation stop (lag time)
Some tumor’s cell die
Volume reduction (clinical negativization)
Surviving fraction restart (recidiva)
Tumor cells proliferation
Cell kinetics:




Proliferating cells
Quiescent cells (could proliferate
but are at rest)
Steryle cells (could not
proliferate)
Death cells (to be removed)
Cell cycle
G1
S
G2
M
G1 or G0
Check points = fasi di arresto della progressione del ciclo con
funzione di controllo della integrità cellulare
Reclutamento = trasferimento dalla fase di quiescenza alla fase di
proliferazione
Tumor growth parameters

Growth fraction


Cell cycle duration (G1 to M)


frazione della popolazione cellulare che muore
Potential doubling time (Tpot)


tempo impiegato da ogni cellula per dividersi
Cell loss


frazione della popolazione cellulare in attività proliferativa
tempo che il tumore impiegherebbe per raddoppiare il proprio volume in
assenza di cell loss
Volume doubling time

tempo di raddoppio reale considerando anche la cell loss





Durata del ciclo = 2 giorni (15 h – 100 gg)
Growth fraction = 40%
Cell loss = 90%
Tpot = 5 gg
Volume doubling time = 70 gg
Fasi della interazione delle radiazioni
ionizzanti con i sistemi biologici
Fase chimica
Effetto diretto


10 -3 sec
Produzione di modificazioni
della struttura chimica delle
specie molecolari del
sistema biologico irradiato
interazione diretta con molecole “biologiche”
rottura legami nella catena nucleotidica del DNA
Effetto indiretto


interazione con le molecole di acqua presenti nella cellula
produzioni radicali liberi (ROS)

fissazione radicali su molecole biologiche

induzione rottura legami chimici

induzione legami anomali

alterazione della struttura della molecola

alterazione della funzione legata alla molecola
danneggiata
Fase chimica
Prodotti della radiolisi dell’acqua

ioni H 2O+
e-

OH°
In presenza di O2
HO2°
O2°

H°
H2O2

Destino dei radicali liberi
inattivazione chimica per ricombinazione
inattivazione “scavenging” da parte di radicali SH
fissazione su molecole biologiche
alterazione molecole biologiche
Molecole biologiche bersaglio
Il danno della molecola del DNA è classicamente
considerato l’evento chimico responsabile del
danno che porta alla morte cellulare
Fase chimica
Effetti sulla molecola del DNA
Struttura del DNA


Macromolecola con struttura a doppia elica costituita da due
filamenti fatti da una sequenza di nucleotidi ; ogni nucleotide è
costituito da una base (Timina, Citosina, Adenina e Guanina),
uno zucchero (desossiribosio) e un fosfato. Le basi sono legate
fra loro dai gruppi zucchero-fosfato. I due filamenti configurati
ad elica sono legati fra loro da legami idrogeno tra le basi (T-A
e G-C).
Durante la fase di sintesi del ciclo cellulare (S) la cellula replica
il proprio DNA. La trascrizione della struttura del DNA è
effettuata attraverso un’altra macromolecola (RNA
messaggero)
Fase chimica
Effetti sulla molecola del DNA

La irradiazione può produrre vari tipi di alterazioni nella
struttura della molecola del DNA per effetto diretto o indiretto

alterazioni delle basi pirimidiniche (T , C ) o puriniche (A , G
)

alterazioni del desossiribosio

rottura di legami con distacco di frammenti e formazione di
nuovi legami nello stesso filamento o crociati

rottura di un singolo filamento dell’elica (Single Strand
Break)

rottura di entrambi i filamenti (Double Strand Break) per
effetto di una singola traccia o di due tracce
contemporanee (hot spots)
Fase chimica
Effetti del danno del DNA

Riparazione completa con restitutio



Riparazione erronea (misrepair)




avviene per la grande maggioranza delle alterazioni minori
la cellula riprende la sua normale attività
la cellula muore dopo alcune divisioni (morte mitotica ritardata)
la cellula muore senza dividersi per accelerazione della morte
programmata (apoptosi)
la cellula non muore ma presenta mutazioni che possono
modificare alcune funzioni
Fissazione non riparabile del danno


la cellula muore subito nel giro di ore per liberazione di enzimi litici
indipendentemente dalla mitosi (morte interfasica); riguarda
alcune specie cellulari specifiche (linfociti, ovociti, cell. salivari
sierose)
la cellula muore in occasione del primo evento mitotico (morte
mitotica) o dopo alcune mitosi (morte mitotica ritardata)
Il danno non riparabile è sostanzialmente
rappresentato dalle doppie rotture (DSB)
Fasi della interazione delle radiazioni
ionizzanti con i sistemi biologici
Fase biologica



effetti biologici conseguenti alle
alterazioni delle molecole biologiche
La manifestazione clinica (effetto clinicamente rilevabile)
dell’effetto biologico delle radiazioni si verifica sempre ad una
certa distanza dalla esposizione (tempo di latenza)
Si parla di effetti acuti per indicare gli effetti che si manifestano a
distanza di giorni da una esposizione singola o nel corso di una
irradiazione frazionata
Si parla di effetti tardivi per indicare gli effetti che si manifestano
dopo mesi o anni dalla irradiazione

Alcuni tessuti rispondono con effetti acuti e con effetti tardivi

Altri manifestano solo effetti tardivi
Alla conoscenza dei meccanismi della reazione tessutale alle
radiazioni ha dato un impulso decisivo la biologia molecolare
Radiobiologia molecolare
Patogenesi del danno da radiazioni
Sequenza dalla biologia molecolare






danno diretto e indiretto della molecola del DNA
danno di molecole della membrana cellulare
danno degli organelli citoplasmatici
innesco dei meccanismi molecolari della reazione cellulare
attivazione della espressione genica di mediatori chimici quali
citochine e fattori di crescita
induzione di una complessa cascata di eventi molecolari a livello della
cellula, della matrice intercellulare, delle strutture stromali i cui effetti
possono manifestarsi in un range temporale estremamente ampio

morte mitotica

differenziazione e avvio alla morte apoptotica

manifestazioni della flogosi

fibrosi

angiogenesi
Tempo di latenza: tempo necessario perché

cancerogenesi
gli eventi molecolari verificatisi al momento

etc:
della interazione producano un effetto visibile
Radiobiologia molecolare
Eventi del danno radiobiologico regolati da mediatori
espressi da geni attivati dalla esposizione alle radiazioni

Induzione morte apoptica

Induzione mediatori della flogosi
(reazione acuta)

Induzione danno endoteliale
(necrosi tardiva)

Induzione produzione collageno
(fibrosi tardiva)

Arresto progressione ciclo

Induzione proliferazione

Variazione microambiente < produzione ROS
(riparazione DNA)
(ripopolazione)
(radioresistenza)
Dose effect relationship
Danno cellulare



studio dell’effetto delle radiazioni sulla capacità delle cellule di
moltiplicarsi
impiego di sistemi cellulari proliferanti in condizioni
sperimentali
studio dei meccanismi generali della risposta cellulare
Danno tessutale

studio degli effetti morfologici e funzionali delle radiazioni su
uno specifico tessuto organizzato
Danno clinico

Studio delle conseguenze cliniche del danno su un determinato
tessuto
Effetto terapeutico

Studio comparativo dell’effetto sulla malattia da curare
rispetto ai tessuti sani circostanti
Metodi di studio della capacità clonogenica
Cellula staminale




Capacità di replicarsi indefinitamente
Capacità di rispondere a meccanismi omeostatici
Mantenimento del compartimento staminale
Mantenimento del compartimento differenziato
Cellula clonogenica

Cellula capace se messa in condizioni opportune di andare
incontro a 5-6 generazioni di cellule formando un accumulo di
almeno 50 cellule
Test di capacità clonogenica


Tecniche per misurare l’effetto delle radiazioni sulla capacità di
formare colonie di cellule clonogeniche
Importanti per lo studio dell’effetto delle radiazioni sulle cellule
tumorali proliferanti
Studio della capacità clonogenica
Curve di sopravvivenza cellulare
Mettono in relazione:

la dose di radiazioni

la frazione della popolazione cellulare irradiata che sopravvive
misurata dalla capacità clonogenica (cellule che conservano la
capacita di formare colonie)
Forma delle curva di sopravvivenza (radiazioni a basso LET)
in scala lineare

sigmoide

la sensibilità delle cellule irradiate può essere espressa dalla dose
necessaria per ridurre la capacità clonogenica del 50% (ED50) o del
90% (ED90) che però non da indicazioni sulla morfologia della curva
in scala semilogaritmica

spalla seguita da tratto rettilineo

dopo la spalla l’effetto è funzione esponenziale della dose

la spalla esprime la capacità della cellula di riparare una parte del
danno

la pendenza della fase esponenziale esprime la sensibilità cioè la dose
-1 livello di effetto ed è indicata da D0
necessaria per ottenere un certo
(dose che riduce la fraz. sopravv. a e )
Studio della capacità clonogenica
Danno letale e danno subletale

La presenza della spalla nella curva di sopravvivenza può essere
interpretata supponendo due possibili modalità di danno cellulare
Danno letale

danno direttamente letale non riparabile (DSB)
Danno subletale





danno che “può” essere riparato dai meccanismi enzimatici
intracellulari restaurando la capacità clonogenica
è espressa dalla larghezza della spalla (dose necessaria prima di
entrare nel tratto esponenziale)
la riparazione del danno subletale richiede alcune ore dopo la
esposizione
è dimostrata la esistenza di una quota del danno subletale che
dipende dalle caratteristiche dell’ambiente in cui la popolazione
cellulare è mantenuta dopo la esposizione
questa quota di danno riparabile si indica con il nome di danno
potenzialmente letale
La forma della curva dose effetto di una popolazione cellulare
ne indica la radiosensibilità
Studio della capacità clonogenica
i parametri della curva
dose effetto possono
variare in rapporto a:






larghezza della spalla
pendenza tratto esponenziale
tipo di popolazione cellulare
qualità della radiazione
tipo di effetto considerato
condizioni ambientali durante (ossigeno, temperatura) e
dopo la esposizione
aggiunta di farmaci
La capacità di riparazione e quindi la radiosensibilità di una stessa
cellula varia durante le fasi del ciclo cellulare
 maggiore in G2 e M
 minore in S e G
4 R’s of radiation biology




Repair of cellular
damage
Reoxygenation of
the tumor
Redistribution within
the cell cycle
Repopulation of cells
Repair of sublethal injury





Sublethal injury – cells exposed to sparse
ionization fields, can be repaired
Killing requires greater total dose when
given in several fractions
Most tissue repair in 3 hours, up to 24
hours
Allows repair of injured normal tissue,
potential therapeutic advantage over tumor
cells
Radioresistance – melanoma?
Reoxygenation



Oxygen stabilizes free radicals
Hypoxic cells require more radiation to kill
Hypoxic tumor areas





Temporary vessel constriction from mass
Outgrow blood supply, capillary collapse
Tumor shrinkage decreases hypoxic areas
Reinforces fractionated dosing
Hypoxic cell radiosensitizers, selective
chemo
Redistribution








Cell cycle position sensitive cells
S phase – radioresistant
G2 phase delay = increased radioresistance
RAD9 gene mutation – radiosensitive yeast
H-ras and c-myc oncogenes - G2 delay
Fractionated XRT redistributes cells
Rapid cycling cells more sensitive (mucosa,
skin)
Slow cyclers (connective tissue, brain)
spared
Repopulation






Increased regeneration of surviving fraction
Rapidly proliferating tumors regenerate
faster
Determines length and timing of therapy
course
Regeneration (tumor) vs. Recuperation
(normal)
Reason for accelerated treatment schedules
Reason against:


Treatment delay
Protracted XRT, split course XRT (designed
delay)
Modelli dell’effetto
radiobiologico
Le curve dose effetto sono state analizzate per elaborare modelli
matematici con i quali interpretare il meccanismo di azione delle
radiazioni
Tra gli scopi dei modelli matematici è quello di rendere i dati
sperimentali trasferibili all’ambito terapeutico, per la elaborazione di
strategie atte a migliorare l’effetto sul tumore e a ridurre gli effetti
sui tessuti sani
Tutti i modelli matematici assumono :





che la cessione di energia nella materia sia un processo random
che la morte cellulare sia connessa al verificarsi di una interazione a
livello di sedi particolarmente critiche delle cellula ai fini della sua
possibilità di divisione
che esistano nella molecola del DNA alcune sedi la cui integrità è
indispensabile per consentire la divisione cellulare
che la evenienza di una doppia rottura in una o più di tali sedi sia la
causa della morte cellulare
che tali sedi siano pertanto da considerare i bersagli o “target” che
devono essere colpiti per avere l’effetto biologico
Modello single target single hit
In ogni cellula esiste un solo bersaglio sensibile la cui inattivazione
produce la morte della cellula
La inattivazione della capacità riproduttiva richiede un unico evento
in questo bersaglio in ogni cellula






Uno certo numero di eventi (hit) dovranno verificarsi nella
cellula perché uno di questi colpisca il bersaglio
La curva che descrive l’andamento della sopravvivenza
cellulare in funzione della dose somministrata è di tipo
esponenziale (lineare in carta semilogaritmica)
La somministrazione di-1 dosi successive distrugge sempre la
stessa % di cellule sopravvissute
La radiosensibilità della popolazione è espressa dalla pendenza
della retta
La pendenza corrisponde alla dose (D°) che riduce la
-1 1 a 0.37 (e
popolazione cellulare da
)
D° è la dose che produce una media di 1 evento (hit) per
target
Modello multi target single hit
In ogni cellula esistono più (n) bersagli sensibili in ognuno dei quali
devono verificarsi almeno un evento per avere la perdità della
capacità riproduttiva







La curva che descrive l’effetto ha una spalla iniziale e una
seconda parte esponenziale
La larghezza della spalla dipende dal numero di bersagli che
devono essere colpiti prima di determinare la morte della
cellula
N = numero di estrapolazione definisce il numero dei bersagli
Dq = è la dose dopo la quale la curva assume un andamento
esponenziale
D° esprime la pendenza del tratto esponenziale
Le cellule che hanno dopo la esposizione un numero di bersagli
colpiti inferiore a (n) possono riparare il danno entro alcune
ore
La larghezza della spalla condiziona l’effetto del
frazionamento della dose
Modello lineare quadratico (LQ)
La inattivazione della capacità riproduttiva può avvenire sia per un
singolo evento in un singolo target che per più eventi nello stesso
target




La prima modalità di danno(componente alfa) ha un
andamento lineare con la dose
la seconda (componente beta) un andamento quadratico
(l’effetto è proporzionale al quadrato della dose)
La curva dose effetto risultante è priva di un tratto retto
La prevalenza della prima o della seconda modalità di
inattivazione determina la forma della curva
La morfologia della curva può essere descritta dal
rapporto alfa / beta
Modello lineare quadratico
Componente alfa







-1
componente lineare del danno (Gy )
corrisponde al danno direttamente letale (non riparabile)
può essere identificata con gli eventi di DSB
è prevalente nelle linee cellulari con scarsa capacità di
riparazione
è prevalente con radiazioni ad alto LET
è prevalente a basso dose rate
risente poco del frazionamento
Componente beta





componente quadratica del danno (Gy-2 )
corrisponde al danno riparabile
può essere identificata con gli eventi di SSB
è prevalente nelle linee cellulari con alta capacità di riparazione
risente molto del frazionamento
Modello lineare quadratico
Rapporto alfa / beta
Poiché:
-1

il parametro “alfa” ha le dimensioni del Gy
-2

il parametro “beta” ha le dimensione del Gy

Alfa / beta ha le dimensioni del Gy
Alfa / beta è la dose (in Gy) alla quale la contribuzione del
danno di tipo lineare corrisponde a quella del danno di tipo
quadratico
Alfa / beta alto
prevalenza di danno non riparabile
la curva dose effetto tende ad essere rettilinea dall’origine
Alfa / beta basso
prevalenza di danno riparabile
la curva dose effetto ha una spalla iniziale più evidente
Modello lineare quadratico
Tessuti normali a risposta acuta
valori alfa / beta
rapido ricambio cellulare
organizzazione gerarchica
cute
mucose alte vie aereo digestive
intestino
midollo emopoietico
7 – 20 Gy
Tumori a rapido ritmo proliferativo
Tessuti normali a risposta tardiva
lento ricambio
organizzazione di tipo flessibile
rene
fegato
tessuto nervoso (encefalo, midollo spinale
Tumori e lento ritmo proliferativo
0.5 - 6 Gy
Prostate
  0.0391 Gy-1

Gy
 /   1.5

0
cell/cm3
 0  10
FOWLER J., CHAPPELL R. and RITTER M.,
Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 50,4,
1021-1031, 2001.