Lezione 9

Considerazione strategiche
1. Scelta del vettore
2. Scelta del sistema cellulare
3. Scelta della tecnica di transfezione
4. Metodo di selezione delle cellule transfettate
2. Scelta del sistema cellulare
1. Facilità di coltura e stabilità
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione
dell’espressione genica
5. Facilità di analisi immunologica o di
purificazione della proteina (espressione di
proteine omologhe)
Considerazione strategiche
1. Scelta del vettore
2. Scelta del sistema cellulare
3. Scelta della tecnica di transfezione
4. Metodo di selezione delle cellule transfettate
3. Scelta della tecnica di transfezione
Microiniezione
Adsorbimento mediante DEAE-Destrano
Coprecipitazione con calcio fosfato
Lipofezione
Elettroporazione
Infezione con vettori virali
Microiniezione
Elevata efficienza (iniezione
diretta nel nucleo)
Impossibile applicazione su
larga scala
Grande manualità
dell’operatore
Applicazioni particolari
(topi transgenici, espressione di
mRNA in cellule di Xenopus laevis)
Microiniezione
Adsorbimento mediante DEAE-Destrano
Formazione di aggregati di DNA (-) e DEAE-destrano (+)
Deposizione sulla membrana cellulare
Internalizzazione per endocitosi
Scarsa efficienza
Elevata degradazione del DNA,
scarsa penetrazione nel nucleo
Utilizzato in cellule con elevata
attività endocitotica
DNA-DEAE
Destrano-TBS
Coprecipitazione con calcio fosfato
La coprecipitazione di aggregati calcio fosfato-DNA sulla
superficie cellulare favorisce l’internalizzazione dell’acido
nucleico
Buona efficienza (5-40%)
Semplice esecuzione
Piuttosto riproducibile
Tossicità cellulare
DNA+CaCl2
HEPES
Coprecipitazione
Lipofezione
Trasferimento di DNA mediato da liposomi
In particolari condizioni è possibile
ottenere liposomi contenenti DNA
DNA
DNA
Buona efficienza
La struttura del doppio
strato fosfolipidico facilita
la fusione con la membrana
cellulare ed il rilascio del
DNA nel citosol
Scarsa citotossicità
Riproducibilità
Lipofezione con reagenti lipidici neutri
I liposomi sono delle sfere di
membrane sintetiche che possono
essere riempite con DNA. Esse
fondono spontaneamente con le
membrane cellulari rilasciando il loro
contenuto nel citoplasma. Sono
disponibile commercialmente dei kit
per la semplice preparazione dei
liposomi.
Lipofezione con reagenti lipidici cationici
Reagenti lipidici cationici in soluzione acquosa formano piccoli
(100-400nm) liposomi unilamellari. La superficie carica
positivamente attrae il DNA (-). Il DNA non è propriamente
“incapsulato” nel liposoma ma piuttosto legato alle sue superfici.
Ogni plasmide si lega a 2-4 liposomi.
L’internalizzazione del costrutto è via endosomi e lisosomi.
LIPOFECTAMINETM
CELLFECTINTM
OLIGOFECTAMINETM
Lipofezione con reagenti dendrimerici attivati
Particolari reagenti commerciali, definiti dendrimerici, possiedono
un’architettura sferica, che si ramifica radialmente da un core
centrale e termina con gruppi amminici ionizzati.
Tali reagenti complessano il DNA in strutture compatte ottimizzando
l’internalizzazione del DNA nella cellula.
Il complesso DNA-dendrimero possiede una carica netta di segno
positivo, che favorisce il legame a recettori con carica negativa (ex.
Glicoproteine sialilate). Una volta all’interno della cellula, il reagente
tampona il pH del lisosoma riducendo la degradazione del vettore.
Elettroporazione
Un campo elettrico altera la permeabilità di membrana
e permette l’ingresso al DNA.
Non c’è endocitosi
Minore esposizione
alle nucleasi
Elevata citotossicità
Adatto a cellule con membrane
particolarmente resistenti
Adatta a cellule in
sospensione
Buona efficienza
Elettroporazione
Le cellule vengono concentrate,
miscelate con il DNA da transfettare
e collocate in una cella collegata a
degli elettrodi. Un breve impulso
elettrico apre in maniera reversibile
dei “buchi” nelle membrane cellulari.
Il DNA entra nelle cellule che vengono
piastrate in terreno fresco.
Infezione con vettori virali
I virus si sono evoluti per trasferire il loro DNA nelle
cellule in maniera efficiente e specifica
Infezione
Lisi
Iniezione del DNA
Assemblaggio
Replicazione
Sintesi del capside
Il genoma virale deve essere modificato
Inserimento del gene di interesse
Eliminazione dei “late genes”, codificanti
per il capside, in modo da evitare la lisi
della cellula infettata
Per la produzione del vettore virale
si rendono necessarie coinfezioni
con i virus “helper” oppure
“packaging cell lines”.
Packaging cell lines
Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali
codificanti per proteine strutturali del capside (late
genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.
La loro transfezione transiente con il DNA-vettore
determina l’impacchettamento del costrutto nel virione.
Si ottiene in questo modo un vettore virale di
transfezione completo.
Vettori virali
SV40. Il primo. Genoma piccolo ed instabile, solo
per cellule di scimmia
Retrovirus. Genoma ad RNA. Integrazione del
vettore. Alta efficienza e capacità. Terapia genica
Baculovirus. Virus degli insetti. Porta all’espressione
ed accumulo di grandi quantità di proteine.
Mutanti virali. Ex. Virus vaccinico iperesprimente la
RNA pol T7.
Considerazione strategiche
1. Scelta del vettore
2. Scelta del sistema cellulare
3. Scelta della tecnica di transfezione
4. Metodo di selezione delle cellule transfettate
Transfezioni stabili o transienti
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e
viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel
genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo
pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel
genoma della cellula ed in presenza di una adeguata
pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi
in coltura.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine
di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate
Transfezione stabile
Durante le prime 48 ore dopo la
transfezione, fino al 50% delle cellule
contengono il DNA esogeno. In seguito,
a causa della degradazione e della
diluizione, le cellule che non hanno
integrato tale DNA nel loro genoma lo
perdono. Per isolare le cellule
transfettate stabilmente occorre
applicare una pressione selettiva,
utilizzando un apposito marker di
selezione.
Marcatori di selezione per cellule di mammifero
ENZIMA
FARMACO
MECCANISMO
Aminoglicoside
fosfotransferasi (APH)
G418 (Inibitore sintesi
proteica)
APH inattiva G418
Diidrofolato reduttasi
(DHFR)
Metotrexate (Inibisce
DHFR)
Variante resistente DHFR
Igromicina
fosfotransferasi (HPH)
Igromicina B (Inibitore
sintesi proteica)
HPH inattiva igromicina
Adenosina deaminasi
(ADA)
9-b-D-furanosil
(XylA)
(danneggia DNA)
Inattiva Xyl-A
Xantina-guanina
fosforibosil transferasi
(XGPRT)
Acido micofenolico
(Inibisce sintesi GMP)
XGPRT sintetizza GMP
Timidina chinasi (Tk)
Aminopterina (Inibisce
sintesi timidina-P)
Tk fosforila la timidina
Timidino chinasi
Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”
L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio
Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT
(Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile
5-fosforibosil-1pirofosfato
Uridina monofostato
AMINOPTERINA
Timidina monofostato
Inosina
monofostato
Guanina
monofostato
Ipoxantina
Adenina
monofostato
Timidina
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Structure of TFMPV-E2/ER ligandbinding domain. (A) The structure of one
monomer of ER is shown as a ribbon
diagram, with the bound GRIP1 coactivator
peptide coloured red. The compound is
shown in a stick representation, with
carbon atoms coloured green, oxygen
atoms coloured red and fluorine atoms
coloured pink. (B) A stereo view of part of
the ligand-binding pocket bound to
oestradiol (top panels; Protein Data Bank
code 1ERE), or TFMPV-E2 (bottom panels).
The ligands are coloured green and are
shown in a stick representation. (C)
TFMPV-E2 is shown in a 2F o–F c electron
density map, contoured to 1.5 . ER ,
oestrogen receptor ; GRIP, glutamate
receptor interacting protein; TFMPV-E2,
trifluoromethyl-substituted phenylvinyl
oestradiol compound
Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
L’esempio della identificazione di Nip-2 e
protimosina
16 h
24h
bnip-2 expression
associates to cell death
48h
20
c
nip 0.5
nip 1.5
nip 2.5
nip2 mRNA
Cell death (dead cells/dish)x
10 2
7
6
5
4
3
2
1
0
15
10
5
0
• Nip-2 pro-apoptotic activity is
blocked by overexpression of Bcl-2
• mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding
domani fail to cause apoptosis
Meda et al. 2001
0
1
4
16
24
48
Hours after Locke
TRANSFECTION OF bnip2 cDNA IN MCF-7 CELLS
BNIP2
%survival
100
CTRL
50
25
% proliferation
0
BNIP2
CTRL
75
CTRL BNIP2
200
150
100
50
0
CTRL BNIP2
Meda et al. 2001
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk
del virus Herpes Simplex
-100
GC
-80
CCAAT
-60
GC
-40
-20
TATA
+1
+
+
+
+
-
Generazione di
mutanti
+ + --+-+-
Trascrizione in
oociti di Xenopus
laevis
Analisi di Northern
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Lo studio della regolazione dell’espressione
genica. I sistemi reporter
X
Elementi di
regolazione
trans
Y
Promotore
Proteina
facilmente
dosabile
Z
Gene reporter
Elementi di regolazione cis
Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che
trans di regolazione della trascrizione.
Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di
interferire con l’espressione del gene reporter.
Questo principio può essere esteso agli animali transgenici
I geni reporter
GENE
VANTAGGI
SVANTAGGI
B-Galattosidasi
(Batterica)
Ben caratterizzata, stabile,
rilevazione automatizzabile
Presenza di attività endogena in
cellule di mammifero, enzima
tetramerico (risposta non
lineare)
Luciferasi
(Lucciola)
Alta attività specifica,
mancanza di attività endogena
(basso background)
Richiede l’aggiunta di cofattore,
O2, ATP.
Fosfatasi
alcalina (Umana)
Proteina di secrezione, saggio
colorimetrico molto sensibile.
Elevata attività endogena in
alcuni tipi cellulari.
Green
fluorescent
protein (GFP,
varianti RFP,
BFP)
Monomerico, non richiede
substrato, assente nei
mammiferi, varianti con
diversa l di fluorescenza.
Bassa sensibilità per mancanza
di amplificazione (non è una
reazione enzimatica)
Screening di molecole farmacologicamente
attive.
ER cDNA
LUC
Potenziali
ligandi
ER ER
LUC
LUC Units
ERE
CTR
E2
CTR
Imaging dell’espressione genica attraverso i
sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e
BFP).
Citosol BFP
Golgi GFP
High-throughput Screening (1)
La possibilità di automatizzare la detezione del reporter
consente uno screening ad “alto flusso”.
Library di
molecole
Saggio biologico
automatizzabile
Piattaforma
Robotizzata
Elaborazione
digitale dei
dati
High-throughput Screening (2)
1990. 20 ricercatori
1.5 milioni di molecole/anno
Oggi. 4 ricercatori
2.5 milioni di molecole/anno
I più moderni saggi di screening consentono la
determinazione della POTENZA e della
SPECIFICITA’ della sostanza testata.
Applicazioni dell’ingegneria cellulare.
Analisi struttura funzione delle proteine
eucariote
RICERCA DI
BASE
APPLICAZIONI
INDUSTRIALI
Riconoscimento della funzione di una
proteina (oncogeni, geni
oncosoppressori)
Studio della regolazione dell’espressione
genica. Analisi di mutazioni di elementi
cis e trans
Screening di molecole
farmacologicamente attive (HTS)
Produzione di biofarmaci
Produzione di biofarmaci
La produzione delle proteine terapeutiche in
microorganismi non è sempre possibile soprattutto
per le modificazioni post-traduzionali
L’utilizzo di cellule animali consente di
ottenere prodotti proteici strutturalmente più
simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà
tecniche e costi più elevati.
Difficoltà nella produzione di biofarmaci
Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per
stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di
copie del vettore, livello di espressione del transgene.
Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore
caratterizzazione prima e dopo il caricamente nell’impianto pilota
Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di
fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks.
Controllo delle condizioni di produzione
Recupero e produzione
Caratterizzazione del prodotto
CONTROLLO
QUALITA’
Controllo di qualità di proteine terapeutiche
Caratterizzazione della proteina
Determinazione dello stato di purezza
Saggio biologico
SDS PAGE/Western
Saggio immunologico
HPLC
SDS PAGE Western
Presenza di proteine seriche
Isoelectrofocusing
Presenza di proteine cellulari
HPLC
Presenza pirogeni
Mappa peptidica
Presenza di DNA cellulare
Sequenziamento N-terminale
Spettrometria di massa
Composizione in carboidrati
Composizione in acido sialico
TPA ricombinante
Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di
mammifero
Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary)
Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini
Assenza di attività tossica per l’uomo
Stabile integrazione di geni eterologhi
Crescita in sospensione o monostrato
Modificazioni post-traduzionali corrette
Alcuni esempi di proteine terapeutiche in commercio
TPA
Insulina
Interferone alfa
hGH
IL-2
G-CSF
FSH
Interferone beta
Eritropoietina
Glucocerebrosidasi
Fattore VII
E.Coli, CHO
E.Coli
E.Coli
E.Coli
E.Coli
E.Coli
CHO
CHO
CHO
CHO
BHK
(Baby Hamster Kidney cells)