Presentazione di PowerPoint - e

Geni e malattie
•
•
•
•
•
Ciò che rende possibile lo sviluppo di
una malattia in un ospite e’ la presenza
nel patogeno di uno o piu geni di
patogenicità, di virulenza e di
specificitaùà per quello specifico
ospite
I geni di virulenza in un patogeno sono
usualmente specifici per uno o pochi
tipi di piante-ospiti
Tale specificità fa si che un patogeno
sia in grado di attaccare un limitato
numero di ospiti
Dal punto di vista della pianta non
suscettibile all’attacco del patogeno
questa viene chiamata resistenza non
ospite
Tutte le piante hanno delle difese preesistenti e indotte che conferiscono
resistenza contro la maggior parte dei
patogeni
• Ogni specie vegetale sembra essere suscettibile a un basso numero di patogeni
(meno di 100 per pianta)
• Nonostante possano essere attaccate da diversi patogeni, possono esistere degli
individui all’interno delle singole specie che presentano un elevato grado di
resistenza e che quindi presentano solo sintomi minori
• Perche’ molte piante non vengono attaccate dai propri patogeni e perche’ molte
di quelle attaccate non muoiono? Accade perche’ le piante attraverso
l’evoluzione hanno acquisito uno o numerosi geni di resistenza che le
proteggono dall’infezione o da sintomi piu’ severi
• Quando compare un nuovo gene di resistenza ad un patogeno la pianta diventa
resistente a tutti I precedenti individui di patogeno
• Tali patogeni hanno di solito uno o piu geni di virulenza e se non compare
nessun nuovo gene In risposta al gene di resistenza l’infezione non puo avvenire
• Come compaiono nuovi geni di resistenza o virulenza?
–
–
–
–
Mutazione
Ricombinazione
Flusso genico
Deriva genetica
Tipi di resistenza ai patogeni
• Le piante possono essere resistenti a un patogeno perchè:
– Appartengono ad un gruppo tassonomico al di fuori di quello ospite di un patogeno
(resistenza non ospite)
– Hanno dei geni di resistenza (geni R) diretti contro geni di avirulenza del patogeno
(resistenza vera o gene per gene)
– Per vari motivi scappano o tollerano l’infezione (resistenza apparente)
• Comunque anche all’interno della stessa specie c’e una considerevole variabilita’
nei confronti della suscettibilita ad un patogeno e di virulenza da parte del patogeno
stesso
Types of Resistance
• Non-host resistance
– i.e., most plants are not hosts to most
pathogens
• Partial, quantitative, or horizontal resistance
– These are the types of resistance that are
most influenced by the disease triangle.
Generally controlled by many genes for many
plant processes or structures
• Race-specific or vertical resistance
– This type of resistance is an “either/or” type
of resistance. Generally controlled by a
single gene
Resistenza apparente
• La resistenza apparente alla malattia in piante note per
essere suscettibili nei confronti di un determinato patogeno
e’ dovuta alla “fuga” dalla malattia o alla tolleranza alla
malattia stessa
• La fuga: la pianta suscettibile non rimane infetta perche’ I
3 fattori necassari per lo sviluppo della malattia (ospite
suscettibile, patogeno virulento, ambiente favorevole) non
coincidono e non interagiscono per il tempo giusto o per
una durata sufficiente
• La tolleranza: e’ l’abilita della pianta di produrre una buon
raccolto anche quando attaccata da un patogeno ed e’ il
risultato di caratteristiche specifiche ed ereditabili che
consentono loro di sopportare l’infezione senza subire
profonde alterazioni fisiologiche
Complete and Partial Resistance
There are two fundamentally different mechanisms
of disease resistance.
Complete resistance
Partial Resistance
AKA vertical resistance
Highly specific (race specific)
Involves evolutionary genetic
interaction (arms race)
between host and one species
of pathogen.
QUALITATIVE
AKA horizontal resistance
Not specific- confers resistance to
a range of pathogens
QUANTITATIVE
Complete and Partial Resistance
There are two fundamentally different mechanisms
of disease resistance.
Complete resistance
Partial resistance
Frequency %
Frequency %
40
30
25
30
20
20
15
10
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Disease severity class
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
Disease severity class
9
10
Gene-for-Gene theory of Complete Resistance
Pathogen has
virulence (a)
and avirulence
(A) genes
A
a
Plant has resistance gene
RR
rr
If the pathogen has an Avirulence gene and the host a Resistance
gene, then there is no infection
Gene-for-gene interactions
vertical resistance
 Avirulence genes first
identified by H.H.
Flor in 1950’s in
studies on rust of
flax
 Pathogens with avr
genes are not
pathogenic on plants
with R genes
 Both avr and R genes
are dominant genes
Gene-for-Gene theory of Complete Resistance
The Avirulence gene codes for an Elicitor molecule or protein
controlling the synthesis of an elicitor.
The Resistance gene codes for a receptor molecule which
‘recognises’ the Elicitor.
A plant with the Resistance gene can detect the pathogen with the
Avirulence gene.
Once the pathogen has been detected, the plant responds to
destroy the pathogen.
Both the Resistance gene and the Avirulence gene are dominant
Gene-for-Gene theory of Complete Resistance
What is an elicitor?
It is a molecule which induces any plant defence response.
It can be a polypeptide coded for by the pathogen avirulence gene,
a cell wall breakdown product or low-molecular weight
metabolites.
Not all elicitors are associated with gene-for-gene interactions.
What do the Avirulence genes (avr genes) code for?
They are very diverse!
In bacteria, they seem to code for cytoplasmic enzymes involved
in the synthesis of secreted elicitor. In fungi, some code for
secreted proteins, some for fungal toxins.
What does a resistance gene code for?
The receptor for the specific elicitor associated with the interacting
avr gene
Genetics of resistance:
Race-specific resistance:
Resistance characterized by
specific genetic interactions
between host genotypes and
pathogen genotypes.
The ranking of cultivars from
least to most resistant depends
on the pathogen genotype (race)
used.
This type of resistance is
commonly qualitative
Pathogen race
Host cultivar
Race-specific resistance is based
on the
Gene-for-Gene Hypothesis :
The product of a single gene in the host
specifically recognizes the product of a gene
in the pathogen.
During an infection event, an interaction
between these products results in
incompatibility
(i.e., a hypersensitive response and
programmed
cell death).
‘’
Gene-for-Gene Hypothesis
Host: ‘R’–gene’= recognizer
this gene produces a product that ‘recognizes’
usually an R-gene is a dominant gene
‘dominant’ means that receiving a copy of the gene from only one
is sufficient to trigger the recognition response in the plant
Pathogen: ‘AVR’ gene’=
avirulence gene
this gene produces an elicitor – ‘elicits the HR’
an AVR-gene is dominant
dominant means that receiving a copy of the gene from only one
parent is sufficient to elicit a recognition response in the host
parent
Geni di patogenicita’
• I patogeni hanno diversi geni che sono essenziali per causare malattia o per
aumentare la virulenza
• I fattori di patogenicita’ sono il prodotto dei geni di patogenicita’ (pat) e di
malattia (dsp)
• Questi geni includono quelli essenziali per il riconoscimento dell’ospite, per
l’adesione ad esso e alle sue strutture, per la germinazione e la formazione di
strutture di infezione, per la penetrazione e la colonizzazione dei tessuti vegetali
• I geni coinvolti nella sintesi e modificazione dei lipopolisaccaridi della parete dei
batteri gram negativi condizionano il range di ospite
• Alcuni enzimi detti CWDE, alcune tossine, ormoni, polisaccaridi, proteinasi,
siderofori e melanine sono prodotti dai patogeni e sono essenziali per causare
infezione e sono quindi dei fattori di patogenicita’
• Quindi I geni di patogenicita’ sono quei geni che rendono un particolare
microrganismo un patogeno
• I prodotti dei geni di virulenza possono essere anche riconosciuti dall’ospite e
alla lunga diventare fattori di avirulenza
Geni di patogenicita’ nei funghi
•
Geni che controllano la produzione delle strutture di infezione
– Molti funghi producono appressori per penetrare la parete vegetale. Ad esempio l’appressorio di
Magnaporthe grisea contiene melanina e I mutanti incapaci di sintetizzare iol pigmento non
riescono a produrre la struttura di infezione. Un altro gene mpg1, che sintetizza per una
idrofobina, e’ fondamentale per il funzioanmento dell’appressorio
•
Geni che controllano I CWDE
– Cutinasi, famiglia multigenica
– Pectinasi, famiglia multigenica
•
Geni che controllano la produzione di metaboliti secondari in risposta alle
– Fitoanticipine, sono prodotte dall’ospite. Sono glicosidi con proprieta simili al sapone che
possono distruggere le membrane. La saponina, avenacina A1, e’ localizzata nell’ epidermide
delle radici di avena. Il fungo Gaeumannomyces graminis infetta l’avena producendo l’enzima
avenacina che degrada la saponina
– Fitoalessine, come la pisatina possono essere degradate dalla pisatina demetilasi che e’ prodotta
dal fungo Nectria
•
•
Geni che controllano la produzione di tossine
Geni legati alla signal transduction
– La distruzione del gene PMK1 in M. grisea riduce la capacita’ di formare l’appressorio. Il gene
CHK1 di Cochliobolus heterostrophus ha una patogenicità ridotta
Geni di patogenicita’ nei batteri
•
•
Adesione alla superficie della pianta
Sistemi di secrezione
–
5 tipi di secrezione
•
•
•
•
•
•
•
•
CWDE
Tossine batteriche
EPS come fattori di patogenicita’
–
–
•
Sono fattori molto importanti sia diretttamente che indirettamente rappresentando una barriera di resistenza ai
ROS
Occlude le punteggiature areolate
Fattori di conversione del fenotipo
–
•
Secrezione di tossine (ABC transporter)
Secrezione di proteine, enzimi, tossine e fattori di virulenza
Il piu importanti per il patogeno, trasporta proteine effettrici nell cellula vegetale
Trasporta macromolecole nella cellula dell’ospite, simili ai fattori di mobilizzazione plasmidica tra batteri
Codifica per adesine
PhcA, un regolatore della trascrizione ce il prodotto dell’operone phcBRSQ che controlla I livelli di PhcA in
dipendenza della densita’ cellulare. Celluel che contengono alti livelli di PhcA porducono molti fattori di
virulenza (EPS, esoenzimi)se viene inattivato il ceppo diventa avirulento ma inizia a produrre PG, siderofori,
Hrp, e proteine di mobilita’
Hrp genes
–
Sono associati ai fattori avr e codificano per proteine dette piline che sono usate per costruire un sistema di
trasporto di tipo 3 per rilasciare fattori avr.
Avirulence genes
 Can be extremely varied, almost anything
can be an avirulence gene
 There are few common characteristics
 Avr genes tend to persist in populations
• Suggests an important role in pathogen
physiology
 Sometimes they code for a virulence
factor, but most have no role in
pathogenicity
hrp genes
 Hrp genes (hypersensitive response and
pathgenicity)
 Found only in gram- bacteria
 Not avr genes but appear to be essential
for the development of hypersensitive
response and disease in non-resistant
plants
 Appear to be involved in the type III
secretion system of bacteria
Interazione avr-hrp-R
• Il prodotto di avr1 induce un
enzima extracellulare a
produrre un elicitore che si
muove liberamente attraverso
la membrana batterica
• I prodotti di avr 2, e 4 così
come le proteine effettore
trasmesse attraverso il
sistema di secrezione di tipi
III si muovono attraverso I
pori formati dalle proteine
hrp e agiscono come elicitori
• I geni di patogenicità/malattia
producono gli effettori
Resistance genes
 Of the genes characterized
to data, the proteins coded
for are quite similar
 Most have a leucine-rich
domain (LRR)
 Resistance gene can be
cytoplasmic or
transmembrane proteins
 Once bound to the avr gene
product, initiate the
cascade leading to HR
Gene for gene interaction
-one gene
Resistance or susceptibility
genes in the plant
R (resistant
dominant)
A (avirulent
Avirulence or dominant
virulence
genes in the
a (virulent
pathogen
recessive)
r (susceptible
Recessive)
AR (-)
Ar (+)
aR (+)
ar (+)
Minus indicates an incompatible reaction (resistance)
Plus indicates a compatible reaction (disease)
Gene for gene interaction
-two genes
A1A2
Avirulence or
virulence
A1a2
genes in the
pathogen
a1A2
a1a2
Resistance or susceptibility
genes in the plant
R1R2
R1r2
r1R2
r1r2
-
-
-
+
-
-
+
+
-
+
-
+
+
+
+
+
Minus indicates an incompatible reaction (resistance)
Plus indicates a compatible reaction (disease)
A common test question:
For each of the boxes, indicate whether or not the
races of a rust pathogen will succeed in infecting the
host cultivars
Resistance (R) or
lack-of-resistance (? or ‘r’)
genes in each cultivar
Avirulence (A) or lack-of-avirulence (? or ‘a’) genes possessed
Race:
A1A2A3A4 A1a2A3A4
a1A2A3A4
a1a2A3A4
a1 a2 a3 a4
r1r2r3r4
R1r2r3r4
r1R2r3r4
R1R2r3r4
R 1R 2r 3R 4
‘R’, ‘A’ = active product present ‘?’, ‘a’, ‘r’ = active product absent
A common test question:
For each of the boxes, indicate whether or not the
races of a rust pathogen will succeed in infecting the
host cultivars
Resistance (R) or
lack-of-resistance (? or ‘r’)
genes in each cultivar
Avirulence (A) or lack-of-avirulence (? or ‘a’) genes possessed
Race: A1A2A3A4 A1a2A3A4
a1A2A3A4
a1a2A3A4
a1 a2 a3 a4
r1r2r3r4
yes
yes
yes
yes
yes
R1r2r3r4
no
no
yes
yes
yes
r1R2r3r4
no
yes
no
yes
yes
R1R2r3r4
no
no
no
yes
yes
R 1R 2r 3R 4
no
no
no
no
yes
‘R’, ‘A’ = active product present ‘?’, ‘a’, ‘r’ = active product absent
avr/R gene combinations to date
• Tomato: avrD/Pto
– Pseudomonas syringae pv. tomato
• Tobacco: replicase proteins/N gene
– TMV, but also other biotrophs
• Rice: avrpi-ta/Pi-ta
– Magnaporthe grisea
• Tomato: Avr2, Avr3, Avr9/Cf2, Cf4, Cf9
– Cladosporium fulva
• Arabidopsis: avrpm1-avrB/RPM1
– Pseudomonas syringae pv maculicola and pv glycinea
Avirulence Gene Function – what is currently known
Avr
Pathogen
Protein
Homology with and/or possible
virulence function *
Location in
the plant
cell
NK ‡
Common domain for avirulence
and virulence function
NK
Location of
the matching
R gene *
NK
AvrPphC
Pseudomonas
syringae pv.
phaseolicola
Interferes with the plant defense
response
AvrPphF
Pseudomonas
syringae pv.
phaseolicola
Interferes with the plant defense response
NK
NK
NK
AvrRpt2
Pseudomonas
syringae pv. tomato
Interferes with the plant defense response
NK
NK
NK
AvrRpm1
Pseudomonas
syringae pv.
maculicola
Enhances growth
Plasma
membrane [
NK
Plasma membrane
AvrPto
Pseudomonas
syringae pv. tomato
Enhances growth
Degradation of resistance gene
Plasma
membrane
No
NK
AvrBst
Xanthomonas
campestris pv.
campestris
Ubiquitin-like protease
NK
Yes
NK
AvrXa7
Xanthomonas oryzae
pv. oryzae
Transcriptional activation domain required for
virulence
Nucleus
Yes
NK
AvrBs2
Xanthomonas
campestris pv.
vesicatoria
Agrocinopine synthase (from Agrobacterium
tumefaciens)
NK
Recognition region localized in the portion NK
with highest homology to synthase
AvrBs3
Xanthomonas
campestris pv.
glycinea
Transcriptional activation domain required for
virulence
Nucleus
Yes
NK
PthA
Xanthomonas citri
Transcriptional activation domain required for
virulence/causes cell hyperplasia [53]
Nucleus
NK
NK
Avr9
Cladosporium
fulvum
NK
Exoplasmic
NK
External plasma
membrane
AvrRpm1 and avrB localise to the plant cell membrane.
Protoplasts from rpm1 plants were transformed with plasmid that express either avrGFP or avrG2A-GFP constructs. Control transformations were with GFP alone.
avrRpm1 N-terminal fatty
acylation sequence
avrRpm1 MGCVSSTSR
Soc3a MGCSVSKKK
Ca sensor
G2A = glycine change to alanine
Loss in avirulence
Protein structure of
cloned resistance genes N
C
Pto
tomato; bacterial resistance
N
C
Xa21
rice; bacterial resistance
N
C
Hs1 sugar beet; nematode res.
Cf9, Cf2 tomato; fungal resistance
N
C
L6 flax; fungal resistance
C
RPS2, RMP1 Arabidopsis; bac. res.
N tomato; viral resistance
Prf tomato; bacterial resitance
N
Membrane anchor site
Transmembrane domain
Serine/threonine protein
kinase domain
Conserved motif
Signal peptide
Leucine zipper domain
Leucine-rich repeat
DNA binding site
Reazione R-avr
Hypothesized physical model
for how R-gene and Avr-gene
products interaction on
plasma membrane of host
cells
= R-gene
product
from
pathogen
Pathogen protein (AVR)
interacts with host R-gene
protein (Cf9), which triggers
the cell death response
(hypersensitivity)
From: MHAJ Joosten and PJGM de Wit
Annual Review of Phytopathology Vol. 37:335
Gene-for-Gene Hypothesis
Host is
Pathogen
Rz,Rz or Rz,?
AVRz,AVRz
or
AVRz, ?
?,?
P
?,?
P
?
H
Resistance
?
?
H
Disease
Disease
?
Disease
Specific recognition in upper left box only
Pathogen
What if the pathogen is a necrotrophic
fungus that produces a host selective
Host
toxin?
S,S or S,?
Tox, Tox
or
Disease!!
P
Tox, ?
Gene-for-gene II
Tox = gene for toxin
S = gene for receptor
Specific recognition in
upper left box only
?, ?
?, ?
P
H
?
Resistant
?
H
Resistant
?
?
Resistant
How many races?
Host cultivar
Pathogen race
Three cultivars, each with a
different R gene yields 8
races (23)
Ten cultivars, each with a
different R gene could
discern a possible 1024
races (210) !!
The set of cultivars used to
characterize races is called a
‘differential set’
L’interazione PG/PGIP
• Le poligalatturonasi sono enzimi del patogeno in grado di idrolizzare la
compenete pectica della lamella mediana
• Le PGIP, polygalcturonase inhibiting proteins, sono delle proteine LRR che
legano le PG del patogeno
• Questo legame fa funzionare “a singhiozzo” le PG liberando in tal modo degli
oligomeri di acido poligalatturonico gli OG
• La lunghezza degli OG non e’ casuale ma si l’interazione fra le 2 proteine crea 2
categorie di OG, I “lunghi”, 20-30 monomeri di AG e I “corti”, 10-14 residui
• Le 2 categorie di OG creati diventano degli elicitori endogeni di HR, ma non
solo, dato che vengono creati anche durante il normale sviluppo della parete
vegetale, servono anche come molecole segnale per reindirizzare lo sviluppo
della pianta
Meccanismi responsabili del riconoscimento
ospite-patogeno
• Attualmente sono stati
ipotizzati 4 meccanismi
possibili:
– Il modello elicitorerecettore
– Il modello “dimero”
– Il modello “ion channel
defense”
– Il modello sopressorerecettore
Modello elicitore-recettore
•
•
•
•
•
•
•
Questo modello suggerisce he almeno 2 gruppi di geni della pianta sono coinvolti:
– Il sensore che riconosce il patogeno
– L’effettore, e cioe I diversi geni di difesa della pianta
Il gene avr del patogeno produce direttamente un elicitore oppure produce un enzima che rilascia un
elicitore
Il segnale e’ chiamato elicitore specifico
Gli elicitori sintetizzati direttamente dal patogeno vengono chimati elicitori esogeni, se invece deriva da
un prodotto di degradazione della pianta e’ endogeno
Il sensore della pianta, il recettore, e’ geneticamente determinato da un gene razza-specifico di
resistenza
Dato che ad un fattore R corrisponde uno specifico fatore avr si parla di una coppia R-avr che detremina
la resistenza razza-specifica
Il recettore si trova presumibilmente sulla membrana plasmatica dove ha maggiore facilita’ di
“incontrare” l’elicitore
Modello “dimero”
•
•
•
•
•
•
Il problema del modello precedente e’ che per scatenare la resistenza, oltre ai geni R servono
anche degli “effettori”, cioe’ altri geni che si accendono in conseguenza del legame recettoreelicitore
Il modello a “dimero”invece si basa sul fatto che un singolo gene della pianta interagendo
con un solo gene del patogeno scatena la reazione difensiva
Si ha un riconoscimento tra molecola sensore e molecola segnale che non avviene nella
membrana plasmatica ma nel citoplasma
Questo dimero agisce come regolatore negativo, bloccando l’espressione dei geni che
portano alla compatibilita’, agendo a livello trascrizionale
Appena la compatibilita di base e’ bloccata, viene ri-accesa la resistenza di base
Questo ultimo punto diverge dal modello elicitore-recettore. Infatti in questo caso non si
parla di ri-attivazione di risposta difensiva ma piuttosto di nuovo meccanismo di difesa
Modello “ion channel defense”
•
•
•
•
•
•
Il modello si basa sul fatto che alcune proteine di membrana che funzionano come canali
ionici abbiano la capacità di stimolare la resistenza razza-specifica
Il modello dà una plausibile spiegazione di alcuni fenomeni osservati, tra cui la risposta
ipersensibile, la morte cellulare in seguito ad HR, e l’attivazione di geni di difesa della pianta
Un importante motivo per proporre tale modello nasce dall’evidenza che la prima reazione di
una pianta soggetta a stress e’ l’alterazione dei potenziali di membrana in segutio a perdita di
elettroliti
Il riconoscimento tra un elicitore e la sua corrispondente proteina transmembrana agisce
come stimolo per far aprire tale proteina legata a dei canali ionici
Questa apertura porta ad un efflusso di ioni K+ e ad un influsso di ioni H+ e ad una
conseguente depolarizzazione della membrana con occasionale distruzione della stessa
Le sostanze liberate da tale evento stimolano la difesa nelle cellule vicine
Modello “ion channel defense”
• Dopo il riconoscimento tra elictore e proteina di membrana quindi
avviene questa depolarizzazione che come detto può provocare la
distruzione del plasmalemma oppure genera una cascata di segnali
• In risposta a questi cambiamenti, infatti, si attivano le kinasi legate
alla membrana, le fosfatasi, fosfolipasi e G protein
• Le kinasi attivano la NADPH ossidasi che trasformano l’O2 in anione
superossido e altre specie attive dell’ossigeno
• I ROS agiscono direttamente sulla parete vegetale rinsaldandola, e
attivano inoltre dei fattori di trascrizione che possono a loro volta
attivare la PCD, l’HR e la sintesi di proteine ed enzimi di difesa
• Altre pathway specifiche vengono attivate e che portano alla
produzione di lipoperossidi, acido jasmonico, etilene e acido
salicilico
• Quest’ultimo e’ anche coinvolto nella diffusione sistemaica della
resistenza attraverso la SAR
Modello “soppressore-recettore
• Il modello propone che tutte le piante siano suscettibili all’attacco da
qualsiasi patogeno, quindi tutte le piante esibiscono una
compatibilita’ di base
• D’altronde tale fenomeno e’ contrastato da un elicitore generico
prodotto da tutti I patogeni che porta alla resistenza di base
• Per colonizzare una particolare pianta il patogeno compatibile deve
quindi produrre un soppressore di tale elicitore generico
• Come fa un patogeno ad essere riconosciuto? Una mutazione insorge
nel soppressore ma non disturba il legame tra soppressore ed elicitore
in tal modo non dà apparentemente nessuno svantaggio al patogeno
• D’altronde questa mutazione può portare ad una mutazione nel gene
R che a questo punto e’ in grado di riconoscere l’elicitore nonstante la
presenza del soppressore
• Quindi avvenendo il riconoscimento tra elicitore e gene R la reazione
diventa incompatibile
Model for the action of Xa21 (rice blight resistance gene)
Leucine-rich receptor
Transmembrane domain
Elicitor
Cell Wall
Membrane
Kinase
Signal transduction
([Ca2+], gene expression)
Plant Cell
The arms race explained
An avirulence genes
mutates so that it’s
product is no longer
recognised by the host
resistance gene.
The host resistance gene
mutates to a version
which can detect the
elicitor produced by the
new virulence gene.
It therefore
becomes a
virulence gene
relative to the host,
and the pathogen
can infect.
Two General Categories of
Defense:
I.
Structural Characteristics
I.
Biochemical/Physiological
Mechanisms
Defense can take the form of both the above & may
differ according to age of the plant, environment,
stress, etc.
Plant Defense mechanisms – 2 types

A. Pre-existing

B. Formed in Response to Infection
Getting inside the host is a critical
step is disease development
Fungal pathogens use ‘contact and chemical tropisms’ to
guide their way to site where infection is possible
Pathogens use several tools to establish a parasitic
relationship: enzymes, growth regulators, toxins
Appreciate that pathogens are highly evolved to enter and
establish a parasitic relationship with their host
Use the timeline as is guide to when events relating to attack
and counterattack take place
Plants respond immediately to a pathogen’s
attempt to get inside
Wound plug (papillae) formation as a result of needle injury:
:
http://bugs.bio.usyd.edu.au/PlantPathology/infection/movie/penetration.html
TIME-LINE OF INFECTION
Outside of host
Inside of host
Fungal pathogen:
Preinfection:
Postinfection
Germination
Haustorium formation (biotroph)
Germ tube search
Toxin formation (necrotroph)
Appressorium formation
Detoxification of phytoalexins
Penetration peg
Reproduction
Host:
General induced
defenses:
Specific recognition:
structural
Papillae
formation
Cork & lignin
layers
Systemic
acquired
resistance
Hypersensitivity Phytoalexins
CONSTITUTIVE DEFENSES
chemical
Host defenses
Constitutive
Structural
wax
cuticle
thickness
shape and
activity of
stomata
Biochemical
pre-formed
inhibitors:
Induced
Structural
cork layer
abscission layer
phenolics
others
Biochemical
hypersensitivity
phytoalexins
gums systemic acquired
resistance
papillae
anti-microbial
tyloses
enzymes
Pre-existing Defenses
The first line of defense against a
pathogen is the plant surface!!
1. Trichomes – hairs- may prevent
pathogen from reaching cell
surface; or reduce water retention.
The leaf surface




Epicuticular waxes: difficult to penetrate- lessens wetability.
Cuticle: difficult to penetrate.
Guard cells: shape, density and size- may make it difficult for
pathogens to enter. e.g. wheat rust – some only open late in the day
when rust can only invade during night or early morning.
Thickness of cell outer wall – may prevent entry or spread of disease.
Pre-existing chemical defenses
 Fungitoxic exudates
• Secreted by plants on their surface,
catechol, coumarins and phenolics
 Intercellular inhibitors
• Phenolics compounds like tannins
• Other compounds like dienes (fatty acid-like
compounds
• Fungal enzyme inhibitors, catechin
• Antifungal enzymes, glucanases, chitinases
Other pre-existing factors
• Lack of recognition factors
– Pathogen fails to respond with critical
processes
• Lack of receptor or sensitive site
– Pathogenicity factor has no effect
• Lack of essential substances
– Certain growth factors or sugars
necessary for pathogen growth
Constitutive biochemical
defense
Onion smudge
In contrast to red and yellow
onions, white onions do not
contain significant quantities
of certain phenolic chemicals
(one is catechol). If present,
these phenolics confer
resistance to onion smudge
disease.
susceptible
resistant
Induced structural defenses
Abscission layer
Cork layer
The formation of
cork or
abscission
layers can limit
the
size of lesions,
and
consequently the
extent of
damage
that can be
caused by a
single infection
Induced structural defenses
Tyloses are
overgrowths of living
cells that protrude via
pits into xylem
vessels blocking the
vascular system.
If they form
abundantly and
quickly, they can stop
the spread of vascular
wilt pathogens. Their
formation is triggered
by a ‘stress
condition’.
 d. Gums –
deposition of gums
(carbohydrate/protei
n) in intercellular
spaces. Forms an
impenetrable barrier.
Pathogen is isolated
and dies. Common
in stone fruit.
2. Cellular Defense
Structures
- changes in the cell wall
- wall appositions/papillae
Response to attempted
invasion very fast.
Composed of:
a. Callose
b. Cellulose
c. Lignin – very
resistant
- encasement –
hyphae or
haustoria are
surrounded by
thickened cell
wall
Inducible plant defense
mechanisms
• Requires recognition of pathogen by
plant
– A chemical specific recognition
– Pathogen elicitors, include toxins,
carbohydrates, fatty acids, proteins,
etc.
– Host plant receptors
• Often transmembrane proteins
• Results in defense response cascade
Necrotic structural defense response
Hypersensitive response is a structural
response (also a biochemical response)
a. Host is penetrated; pathogen contacts
protoplast
b. Nucleus migrates to site, disintegrates, cell
membranes are disrupted, host cell dies.
c. Cell browns and pathogen dies
Important defense against obligate parasites,
nematodes, some bacteria, some facultative
saprobic fungi
Usually, pathogen is dependent on living tissue; thus
disease is limited.
Necrotic structural defense response
Induced Metabolic Defenses:
Horizontal resistance
Many of the same compounds associated with
pre-existing defense response are important in
inducible response
The primary difference is that the presence
and amount of such compounds is a result of
interaction between pathogen and plant, i.e.,
a result of chemical signals…elicitors
Induced Metabolic Defenses:
Horizontal resistance
Stimulated by elicitors
1. Host elicitors: cell wall components –
glucose
2. Pathogen elicitors: cell wall components –
beta-gucans, chitin
3. Heavy metal ions: Cu, Cd, Zn
4. Temperature induction – cold hardening, heat
shock. Also other abiotic stresses.
1. Phytoalexins – are toxic substances produced only
after stimulation by pathogenic microorganisms,
chemical or mechanical injury such as insect
feeding. Most inhibit growth of fungi, but some
are active against bacteria and nematodes.
Phaseollin, pisatin, glyceollin, gossypol, capsidiol
Induced Metabolic Defenses:
Horizontal resistance
2. Increase Phenols
Many different phenolic chemicals accumulate in cells
and kill pathogens
3.Oxidize phenols to quinones: more toxic to microbes
4. Substrates resisting enzymes of the pathogen.
Pectin is susceptible to enzymatic decay, but is more
resistant if complexed with divalent cations (Ca or Mg)
Induced Metabolic Defenses:
Horizontal resistance
5. Fungitoxic Cyanide-derivatives.
HCN incorporated in wall linked by
sugar molecule; when pathogen
degrades wall release sulfur
compounds and cyanide.
Respiratory toxin.
6. Detoxification of Pathogen Toxins
Fungal toxins that kill plant cells can be
metabolized by enzymes produced by host
7. PR proteins – pathogenesis-related proteins
Usually an antimicrobial enzyme: chitinases,
beta-glucanases, proteinases, lysozymes
Hypersensitive Reaction/ Programmed
Cell Death
In response to signals, evidence suggests that infected
cells produce large quantities of extra-cellular
superoxide and hydrogen peroxide which may
1/ damage the pathogen
2/ strengthen the cell walls
Oxidative
3/ trigger/cause host cell death
Burst
Evidence is accumulating that host cell also undergo
changes in gene expression which lead to cell death
Programmed Cell Death
Plant Defense: Hypersensitive Response
• Localized resistance mechanism due to recognition of a pathogen
• R (Resistance) genes from the host mediate recognition of effector
proteins secreted from the bacterium
• Leads to rapid death of cells at the site of infection due to activation of
defense genes
Induced Metabolic Defenses:
Vertical resistance
The hypersensitive response
Many of the same
compounds associated with
hypersensitive response
are associated with
induced horizontal
resistance. The primary
difference here is that
their production during HR
is accompanied by
programmed cell
death…apoptosis
Induced Metabolic Defenses:
Vertical resistance
Hypersensitive Reaction
A type of programmed cell death – apoptosis.
Invaded cells and some surrounding cells die.
Characterized by:
1. recognition of pathogen avr genes by host resistance
genes
2. increased ion movement across membranes
3. rapid burst of reactive oxygen species (ROS),
superoxides and nitric oxide
4.phenolics, jasmonates and salicylic acid –signaling
molecules
5.degradation of DNA, membranes disrupted, cell
death.
6. Production of PR protein is induced, which further
induces Systemic Acquired Resistance (SAR)
L’HR e la PCD
•
•
•
•
•
•
•
L’HR, che consiste in una morte cellulare localizzata molto rapida nel sito della tentata
infezione, si trova in tutte le risposte di difesa: quelle mediate da uno o più geni R, nella
resistenza non ospite e in molti casi di resistenza poligenica o quantitativa
L’interazione tra un elicitore e il suo recettore porta immediatamente a eventi di signal
transduction dovuto ad un rapido flusso di ioni transmembrana
Questo flusso porta all’alcalinizzazione dell’apoplasto, alla formazione di ROS, alla
produzione di NO, all’attivazione e all’attivazione di una cascate di segnale che coinvolge la
pathway delle MAPK e alla fine ad una attivazione della trascrizione di geni di difesa
Questa riprogrammazione trascrizionale risulta nella produzione e nel rilascio di composti
antimicrobici o nella generazione di molecole segnale che possono agire a distanza
instaurando così una risposta sistemica acquisita (SAR)
L’HR non e’ sempre necessaria per la difesa. Se il sistema dei geni R riesce a confinare
l’invasione allora la PCD non e’ piu’ necessaria. La PCD e’ comunque controlata da SA, JA,
ET ed NO e dalla produzione di ROS.
La distruzione del gene lsd1 (lesion simulating disease) porta alla generazione di piante che
sono incapaci di bloccare la propagazione della PCD e quindi di confinarla al solo sito
d’infezione. Le cellule delle piante Dlsd sono ipersensibili all’anione superossido, alla
presenza del quale muoiono rapidamente (runaway cell death-rcd)
Botrytis cinerea attacca a induce la rcd nelle cellule che presentano il gene lsd1. Infatti subito
dopo l’infezione il fungo produce e rilascia H2O2 e superossido (convertito rapidamente dalla
SOD in H2O2). Questi ROS attivano la HR e la PCD. In tal modo il fungo riesce a “simulare”
l’HR per colonizzare I tessuti morti
Hypersensitive response
Can be very
localized, just a
few cells and
difficult to see,
or it can involve a
much larger area
of the leaf
surface
Can lead to SAR
Local lesions – restricted HR
I ROS e le LOX
•
•
•
La membrana cellulare e’ un sito attivo per l’induzione di meccansimi di difesa, infatti
serve come ancora per I geni R che riconoscendo gli elicitori sono in grado di stimolare le
risposte di difesa
In molte combinazioni ospite-patogeno I cambiamenti che avvengono nella membrana
svolgono un ruolo importante nella difesa
Le più importanti risposte che avvengono a livello di membrana includono:
– Il rilascio di molecole importanti per la signal transduction sia nell’intorno della cellula che a
livello sistemico
– Il rilascio e l’accumulo di ROS e di enzimi lipossigenasici
– L’attivazione di fenolossidasi
•
•
•
•
•
In molte interazioni pianta-patogeno la prima risposta della pianta e’ la produzione di
ROS. Queste specie reattive come l’anione superossido, l’idrossil radicale e il perossido
d’idrogeno sono prodotti a partire dall’azione di una NADPH ossidasi di membrana dopo
pochi secondi o minuti dal contatto con il patogeno o con un suo elicitore
I ROS stimolano la perossidazione dei lipidi di membrana che se prodotti in alta
concentrazione diventano tossici possono essere coinvolti nella morte HR
La presenza dei ROS blocca comunque anche l’avanzamento del patogeno
L’ossidazione delle membrane coinvolge l’attivazione di varie LOX che ossidano gli FFA
rilasciati dalle membrane lipidiche
Molti di questi LOOH vengono usati come precursori per la produzione di JA e di
traumatina che agisce come trasduttore del segnale nelle reazioni di difesa
Le PR proteins
• Le proteine relative alla patogenesi (PR) sono proteine tossiche per il patogeno
prodotte in grande quantità quando la pianta viene attaccata
• Si trovano sia a livello intra che intercellulare a livello di parete vegetale
• I diversi gruppi di PRP sono stati classificati in base alla funzione svolta, alle
relazioni sierologiche, alle sequenze AA, al MW e ad altre proprieta’
• Le PRP possono esssere o estremamente acide o basiche e quindi facilmente
solubili e reattive
• Si conoscono almeno 14 classi di PRP, tra queste le PR1, (antioomiceti e
antifungine), le PR2 (b-1,3-glucanasi), le PR3 (chitinasi), le PR4 (antifungine), le
PR6 (inibitori di proteasi), le defensine, le thionine, I lisozimi, le proteine simili
all’osmotina, le LOX, le proteine ricche in cys, le proteinasi, le chitosanasi e le
perossidasi
• Ci sono molte isoforme di ciascuna PRP nelle varie piante
• I composti segnali che attivano la produzione e l’attivazione di PRP sono l’SA,
l’ET, le xilanasi, la sistemina, il JA
Hypersensitivity- Specific Recognition
Some host cultivars can
recognize certain
pathogen isolates and
trigger an HR whereas
others can not. In this
picture, the two inner
cultivars are exhibiting
an HR.
Combinations of two or
more HR-inducing
recognition events can
give rise to pathogen
‘races’ (more on this
later).
S
HR HR
S
Localized
cell death
Specific recognition event triggers programmed cell
death pathway
Specific recognition
NO = Nitrous oxide
Timeline Review: Barley powdery mildew race A
Percentage of Conidia
100
is inoculated onto different host and nonhost plants:
At what point on the timeline do the spores fail?
On wheat
On susceptible
barley
50
On tulip
0
On resistant
barley with HRtype resistance
Induced biochemical defenses
• Phytoalexins: antibiotics synthesized by and
•
•
•
•
accumulated in plant host cells near those cells that
have been attacked by pathogens
Synthesized in healthy cells near an infection site –
i.e., local induction
Synthesis occurs all host cultivars but the rate (speed)
of synthesis can vary among cultivars – an HR
typically induces synthesis in nearby cells
Most plants produce several phytoalexins
(e.g., over 20 have been isolated from potato)
Enzymes to detoxify phytoalexins have been observed
in some fungal pathogens
Phytoalexin molecules
Several hundred have been isolated and characterized
from at least 15 plant families
Example of attack and counterattack
Fungal pathogen
Phytoalexins are
synthesized
in response to
pathogen attack
Some pathogens
counterattack
producing enzymes
that
degrade the
phytoalexin
Host cell
Induced Resistance
 Develops after pre-inoculation of plants
w/various biotic agents or after pre-treatment
with various chemical or physical agents.
 It is non-specific since, regardless of the agent
used as the inducer resistance is increased for
a variety of pathogens.
 Local Acquired Resistance
 Systemic Acquired Resistance (SAR)
Infection is localized, after several days, plant
is resistant to attack in other areas. Usually
resistance is expressed as small local lesions or
complete resistance (no symptoms).
Systemic Acquired Resistance
Inducer inoculation
3 days to months,
then inoculate
SAR- long-term resistance to a range of
pathogens throughout plant caused by
inoculation with inducer inoculum
Local
acquired
resistance
Systemic
acquired
resistance
Induced biochemical defenses
• Systemic Acquired
Resistance is the
activation of defenses
in distal, non-infected
parts of the plant.
2
1
The plant becomes
more resistant to a
secondary, challenge
inoculation there
After a primary
inoculation here
Systemic Acquired Resistance
• SAR confers broad-based resistance to different
pathogens. For example, primary inoculation with a
fungal leaf spot pathogen reduces susceptibility of
the host plant to other fungi as well as to bacterial
and viral pathogens
• Salicylic acid (chemical related to aspirin) is part of
signaling pathway involved in transmission of the
defense response throughout the plant to produce
SAR. This has lead to the development of synthetic
chemicals that mimic the role of salicylic acid
Induction of Systemic Acquired Resistance
1- Production of H2O2 (plus antioxidants)
Hydrogen peroxide has been associated
secondary induction of SAR and direct
toxic activity to invading pathogens
2 - Thickening of plant cell wall
Production of phenolics (lignin, tannic acid) that
strengthen walls and inhibit pathogen enzymes
3- Accumulation of pathogenesis related proteins
“PR-proteins” enzymes that degrade fungal cell
walls: chitinases, ß-1,3 Glucanases
These enzymes accumulate in vacuole of plant cell. Upon attack,
they directly degrade fungal cell walls. Indirectly, their action
results in the release of fungal wall components that elicit
additional defense reactions
Sprayed inducer
(activator)
that mimics
salicyclic acid
Plants can have more than one type of
acquired resistance
Pathogens
or synthetic
chemicals
Strains of
bacteria
living on
roots
Plant Defense: Systemic Acquired Resistance
• Following HR, increased resistance
throughout the plant
• Due to increased expression of
pathogenesis-related genes
• Long-lasting effect
• Salicylic acid is required for induction
Signal transduction nella SAR
•
•
•
•
•
•
•
•
Le difese indotte sono regolate da una rete di pathway di segnalazione interconnesse in cui I
componenti primari sono l’acido salicilico (SA), l’acido jasmonico (JA), l’etilene (ET) e
l’ossido nitrico (NO)
La pianta reagisce all’attacco di un patogeno aumentando la produzione di queste sostanze
mentre un distinto set di geni relativi alla difesa attiva nella resistenza gene per gene tenta di
bloccare l’infezione
L’acido salicilico reagisce con diverse proteine tra cui l’ascorbato perossidasi e la catalasi
(enzimi scavengers dell’H2O2) e con una proteina plastidiale con attivita’ antiossidante
La principale via di difesa stimolata dal SA e’ quella legata all’attivazione delle PR
(pathogenesis related) proteins. Alcuni dei geni “accesi” dal SA attivano altri geni connessi
con la sintesi di JA e di ET
L’NO invece induce la sintesi di PR1 e dell’enzima PAL che e’ alla base della formazione di
SA
L’SA di solito non e’ richiesto nelle prime difese stimolate dai geni R ma piuttosto per la
propagazione ed il mantenimento della risposta sistemica secondaria (SAR)
Tutti gli ormoni (SA, JA, ET) si influenzano reciprocamente in modo positivo o negativo
durante le risposte difensive generando un cosiddetto “crosstalk”
Il crosstalk fornisce un potenziale regolativo per attivare diversi meccansimi di resistenza in
varie combinazioni e svolge un ruolo nel determinare quale via difensiva attivare
Salicylic Acid
•Colorless, crystalline organic carboxylic acid
•Functions as a plant hormone
•All cells capable of synthesizing
•Released by cells with in favorable environmental conditions;
allow survival at current metabolic level
•Acts by rapid local increases then rapid decreases in levels
•After survival threat has passed, returns to normal functioning
•Increases cell metabolism rate to take advantage of more
advantageous nutrient and environmental conditions
•Sustained level of SA may occur if a cell reaches peak metabolic
levels and may signal that resources can be turned to growth
Salicylic Acid (SA)
COOH
OH
• Accumulates in both local and systemic
tissues (not the systemic signal)
• Removal of SA (as in nahG plants) prevents
induction of SAR
• Analogs: INA or BTH
Jasmonic Acid
•Methyl jasmonate catabolized from
jasmonic acid, more volatile; may
act as airborne signal messenger to
neighboring undamaged plants
•Herbivore oral secretions contact
damaged plant tissue & prompt
release of volatile organic molecules
that attract herbivore predators;
methyl jasmonate may be involved
Plant Defense: Jasmonic Acid Pathway
Coronatine
•Phytotoxin produced by some plant-pathogenic bacteria
•Mimics the action of methyl jasmonate (MeJA) in plants
CFA - Polyketide coronafacic acid
CMA - Cyclized amino acid; coronamic acid
Previous study: Investigate SA/JA cross-talk
Conclusion: Not a simple mechanism where
resistance to bacteria = susceptibility to caterpillar
Three ways plant
hormones interact:
Mode I - Response Level
-Hormones interact by regulating a
common set of genes
ie. Auxin response genes regulated
by ethylene and gibberellins
Many genes regulated by ethylene
and JA signaling pathways
Mode II - Signal Transduction Level
-One component functions in both
signaling pathways
ie. JA/COR signaling affects plant
response to both pathogen and
herbivore
Mode III - Biosynthesis Level
-Production of one hormone alters
in response to second hormone
ie. SA negatively regulates JA
www.stke.org/cgi/content/full/OC_sigtrans;2001/70/re1
MeJA, CMA, CFA
•Methyl jasmonate (MeJA) is an inducer of the JA pathway
- COR is a MeJA mimic
•CMA and CFA are compounds that come together to form COR
MODEL
Virulent P. syringae
Avirulent P. syringae
Disease
HR
JA/COR
SA
T. ni
susceptibility
T. ni
susceptibility
T. ni
resistance
SIS  Disease
SAR  No disease
Mutants affecting SA synthesis
• Elevated SA accumulation
– dnd1 (defense, no death 1): increased SA, but
reduced HR, DND1 gene encodes cyclicnucleotide-gated ion channel
– mpk4: constitutive SA accumulation
– edr1 (enhanced disease resistance 1): defective
MAPKKK
Mutants affecting SA synthesis
• reduced SA accumulation
– eds1 (enhanced disease susceptibility 1): lipase
homolog
– pad4 (phytoalexin deficient 4): another lipase
homolog
– sid1 and sid2 (salicylic acid inductiondeficient): defects in chorismate pathway
NPR1: non-expresser of PR
genes
•
•
•
•
•
Also known as NIM1 or SAI1
Positive regulator of SAR
Downstream of SA, upstream of PR genes
npr1 mutants are susceptible to various pathogens
Overexpression of NPR1 generates broadspectrum resistance
• Unique, but similar to Iκ-B (negative regulator of
immunity in animals)
NPR1 overexpression
Pathogen-Related (PR) Genes
•
•
•
•
Antimicrobial properties
Many identified
Categorized according to activity
Examples
– PR-2 : beta-1,3-glucanase
– PR-3 : chitinase
– PR-12: defensin
SAR
Avr
R gene
SA
NPR1
PR-1 PR-2 PR-5
SAR
Structural features of NPR1
npr 1-2
nim 1-2 npr 1-1
NLS
SS
BTB
ARD
• 593 amino acids, 67 kD
• Two protein-protein interaction domains:
BTB/POZ and Ankyrin repeats
• Contains NLS
• Multiple phosphorylation sites
• No DNA binding domain
TGA Factors
• Found to interact with NPR1 through yeasttwo hybrid
• bZIP transcription factors
• Six members in Arabidopsis (TGA1-6)
• Might be redundant
• Bind to as-1 element
NPR1-TGA2 interaction
• Direct visualisation
SAR
Avr
R gene
SA
TGA2
NPR1
PR-1 PR-2 PR-5
SAR
Current model
Figure 6
SAR
Avr
R gene
SA
TGA2
NPR1
TGA5
PR-1 PR-2 PR-5
SAR
SAR independent
resistance
Why are secretion-related proteins induced?
• Hypothesis: A coordinated up-regulation of
protein secretion machinery is required for
the proper folding, modification, and
transport of PR proteins.
Genetic Evidence
•
•
•
•
•
•
Mutant analysis:
Calnexin mutant
PDI mutant
BiP2 mutant
DAD1 mutant
SEC61 mutant
No visible phenotype
Inability to transport PR
proteins when induced by
SA analog (S-methylester)
Conclusions
• NPR1 not only induces PR genes but also
secretion-related genes
• These secretion-related genes are required
for the efficient transport of PR proteins and
SAR induction
• NPR1 interacts with a cis-element (TL1) to
induce secretion-related genes separately
from the PR gene element (as-1)
Similarity with animals
1/ Resistance/avirulence gene interaction is analogous to
animal antibodies- involves protein-protein binding
is highly specific
2/ Oxidative burst is analogous to neutrophil action
3/ Programmed cell death is common to both plants and
animals
4/ Systemic acquired resistance is like immunity?
Convergent evolution!!!!
…per riassumere!
Powdery mildew disease
•
•
•
•
•
•
•
•
•
I funghi che causano questa malattia attaccano 10000 specie di piante appartenenti a piu di
1600 generi
Le difese contro questi funghi sono ottenute grazie a dei geni R. Tra questi e’ stato studiato il
gene Mla di orzo che conferisce la resistenza a 32 razze di Blumeria graminis f.sp. Hordei
Mla e’ una proteina recettore con domini CC-NB-LRR capaci di riconoscere almeno 3 fattori
AVR del fungo
I geni Rar1 e SGT1 sono sotto il controllo di Mla e sono fondamentali per lo scatenamento
delle risposte di difesa
Rar1 e’ sotto il controllo di un altro fattore, RPW8, proteina che presenta dei domini
transmembrana ed e’ coinvolta nella resistenza dell’orzo a diverse powdery mildews. RPW8
induce, anche attraverso il coinvolgimento di Rar1 e di acido salicilico, l’accumulo di ROS,
la morte ipersensibile e l’attivazione di PR-1 proteins
Si pensa che RPW8 agisca come fattore di compatibilita’ che rende possibile il trasporto di
molti fattori di patogenicita’ all’interno dell’ospite. In tal modo RPW8 consente ai recettori
intracellulari di riconoscere tali fattori e di attivare le risposte difensive
Una caratteristica della resistenza dell’orzo mediata da Mlo a Blumeria e’ quello di essere
capace di bloccare l’infezione anche dopo la penetrazione senza necessita’ della morte
ipersensibile
Il tentativo di penetrazione del fungo porta a rimodellare la parete cellulare intorno all’ifa di
penetrazione e all’appresorio
In tale sito si accumula no ROS e composti fenolici antimicrobici
Magnaporthe grisea
• Il conidio del patogeno germina rapidamente e tenta di penetrare la superficie
fogliare, in 4 ore l’apice del tubo si allarga, la parete si inspessisce con
l’apposizione di melanina
• Numerosi geni sono attivi durante questo processo, una idrofobina (MPG1) che
aiuta l’appressorio a riconoscere le superfici idrofobiche della foglia; il gene Pth11
che sembra essere coinvolto nella signal transduction legata alla formazione
dell’appressorio cosi come magB che codifica per una proteina G e la MAPK
PMK1.
• PMK1 controlla in particolare la germinazione conidica attraverso la degradazione
di glicogeno e lipidi che proprio grazie al segnale trasdotto da questa MAPK,
vengono mobilizzati verso l’appresorio in formazione
Fusarium
•
•
•
•
•
•
•
Fusarium oysporum consiste di piu di 120 formae specialis a seconda dell’ospite infettato.
Ogni f.sp. e’ ulteriormente suddivisa in razze fisiologiche ognuna con un caratteristico
pattern di virulenza su diverse varieta dell’ospite
Il cambiamento di pH del suolo induce l’attivazione di un fattore di trascrizione che attiva
geni specificamente attivi in condizioni di alcalinita’ ementre inibisce I geni attivi a pH acidi,
alterando la crescita e le capacita di patogenesi
I primi segnali di riconoscimento fungo-pianta includono il fattore di trascrizione CTF1b.
Questo media l’attivazione di cut2 che codifica per una cutinasi che una volta attiva attacca
la cutina della pianta rilasciando nell’ambiente monomeri di cutina. Questi stimolano
l’attivazione di CTF1 che attiva a sua volta la cutinasi principale, cut1.
L’adesione e la penetrazione nella radice sono sotto il controllo di una MAPK. Questa
controlla l’attivazione sequenziale di molti CWDE che vengono poi rilasciati anche
all’interno dei vasi infetti
Una volta dentro la pianta il fungo entra in contatto con sostanze anttimicrobiche preesistenti
come fitoanticipine e fitoalessine. In particolare il pomodoro produce la saponina tomatina, la patata -calconina e -solanina. Il fungo produce degli enzimi in grado di
tagliare queste molecole in composti non tossici
Il fungo e’ anche in grado di degradare le fitoalessine attraverso degli enzimi demetilasici
Pda2 e PdaL e H
Le varie specie di Fusarium sono anche in grado di produrre molte sostanze tossiche come ad
esempio le fumonisine. Queste sono in grado di interferire con la sintesi delle cere
superficiali e inducono apoptosi.
Targets for Improvement
For example, rice
Targets for improvement in rice production fall into three categories
Biotic constraints- (pests and diseases)
Weeds, Fungi (e.g. Blast), Bacteria (e.g. Blight), Viruses (e.g. Rice
yellow mottle virus), Insects (e.g. Brown plant hopper), Nematodes
(e.g. Cyst-knot nematode)
Abiotic constraints (adverse physical environment)
Drought, Nutrient availability, Salinity Cold, Flooding
Yield and quality
Plant morphology, Photosynthetic efficiency, Nitrogen fixation,
Carbon partitioning, Aroma
Marker Assisted Selection in Disease Resistance
Resistance genes can be selected for by screening with the disease.
So, conventional breeding can produce resistant varieties.
But, resistance genes break-down. The disease organism mutates to
overcome them (in 2-3 years).
If there were several resistance genes, the disease organism would
take very much longer to overcome all resistance genes (in fact it
is virtually impossible).
But, you can’t select for say 3 resistance genes conventionally- you
can’t tell the difference between 1 gene and 2 or 3 by phenotype.
But if you select for markers linked to the resistance genes, you
can introduce multiple resistance genes.
Marker Assisted Selection in Disease Resistance
Donor1
Donor 2
Donor 3
Selectable markers
Elite variety
Multiple crosses
followed by
backcrossing
with selection for
markers at every
stage
Elite variety with
multiple resistance
genes
Vantaggi e svantaggi nel breeding della
resistenza orizzontale e verticale
• La resistenza può essere ottenuta incorporando uno, pochi o molti geni di resistenza
in una varietà. Alcuni di questi geni possono controllare alcuni importanti steps
nello sviluppo della malattia e quindi svolgono un ruolo importante nella resistenza
• La resistenza verticale
– e’ utile contro specifici patogeni o specifiche razze di patogeno
– E’ maggiormente efficace quando
• E’ incorporata in specie annuali, facile da migliorare come I cereali
• E’ diretta contro patogeni che non si riproducono e diffondono rapidamente come Fusarium o
contro patogeni che non mutano frequentemente come Puccinia
• Consistono di geni R “forti” che conferiscono una resistenza completa e a lungo termine
• La popolazione ospite non consiste di una varieta uniforme geneticamente
– Se una sola di queste condizioni non si verifica la resistenza diventa di breve durata e
compaiono nuove razze di patogeno che bypassano le difese dell’ospite
• La resistenza orizzontale
– Conferisce una resistenza parziale ma di più lunga durata
– Tale resistenza coinvolge più processi fisiologici dell’ospite che agiscono come
meccansimi di difesa e che sono degli ostacoli impossibili da superare per il patogeno
– Le piante con la resistenza orizzontale rimangono resistenti più a lungo ma con minore
intensita’
Multilinee e piramidalizzazione
• Le varieta’ con la resistenza verticale sono spesso attaccate all’improvviso da nuove
razze di patogeno e questo può portare a delle vere e proprie epidemie
• Per evitare questo svantaggio, cioe’ l’inefficienza della resistenza affidata a pochi
geni, vengono oggi usate le multilinee attraverso la piramidalizzazione
• Le multilinee sono una miscela di varieta’ individuali (linee e cultivar) che sono
agronomicamente simili ma che differiscono nei loro geni di resistenza
• La piramidalizzazione consiste nell’uso di varietà che sono derivate dall’incrocio di
molte varietà che contengono geni R diversi e poi selezionando da queste solo
quelle che contengono una miscela di tutti I geni R
• Le multilinee e la piramidalizzazione sono stati sviluppate come metodiche
soprattutto nella lotta contro le ruggini dei cereali, ma il loro uso sta decisamente
aumentando anche in altri sistemi pianta-patogeno
Genetic transformations
Agrobacterium transformations
Direct transfer methods for transformation
Transformation cassettes
From transformed cells to plants
The use of transformed plants in research
Mutants
Transposon
Transposon and T-DNA tagging
Genetic Engineering of PlantsAgrobacterium transformationThe bacteria Agrobacterium tumefaciens causes galls or tumors on plants
Genomic DNA
Ti Plasmid
(tumor inducing)
T-DNA
(transfer)
Restrict and ligate together
Foreign DNA
T-DNA
(transfer)
Re-introduce recombinant DNA
Agrobacterium transformation 2
Infect plant with
recombinant agrobacterium
Grow up transformed
plants from single
cells
Whole T-DNA transferred
randomly into plant
chromosome
“GENETIC ENGINEERING” without
AGROBACTERIUM
All involve getting DNA directly across the plasma membrane
Shock of protoplasts
Micro-injection
Biolistics
Transformation constructs or cassettes
•Genes of interest
•Promoter
•Selectable (marker) gene
Gene of interest
T-DNA
Promoter
e.g. Cauliflower
Mosaic Virus 35S
RNA gene
promoter
(CAM 35S)
T-DNA
Selectable marker-gene
e.g. antibiotic resistance
or herbicide resistance
Allows transgenic cells to be
selected from
non-transgenic
From transformed cells to plants
Plant cells are grown as a callus of
undifferentiated cells on agar
plates
transformation
After transformation, cells grown
on selective media (e.g. containing
antibiotic)
selection
Untransformed cells die
Transfer to
tube with
hormones
Cells containing transgenes grow
into plantlets
Transposons and T-DNA tagging
Transposons have only been found in a few plants (e.g. Maize,
Antirrhium). But, they can be introduced by transformation. The Ac
transposon has been introduced to tobacco, Arabidopsis, potato,
tomato, bean and rice.
Mutations using transposons or T-DNA (both of which insert
randomly into nuclear DNA) are produced by transformation
methods described earlier. Large numbers of plants are screened for
an observable phenotype (e.g. lack of response to light).
Screen
Identify mutated
gene
Transposons and T-DNA tagging
The gene into which the insert has occurred can be recovered by PCR
Mutated ORF
Insertion (Transpososn or T-DNA)
Restrict
Ligate
PCR amplify using primers
homologous to and facing out of
insert
Transposons and T-DNA tagging
In Arabidopsis and maize, large collections of Tansposon
and T-DNA tagged mutants have been developed over the
last few years.
In Arabidopsis, you can get a mutant of any gene you want
They represent a fantastic tool for the discovery of plant
genes and gene function.
Da cellule singole si possono
far crescere piante intere
• Se una pianta viene incisa sotto la ferita si
ha una proliferazione cellulare detta callo
• Se un frammento di callo giovane è rimosso
e posto in un terreno di coltura contenente
i nutrienti e gli ormoni appropriati
• In seguito il callo si differenzierà in
germogli e radici e alla fine sarà prodotta
un intera pianta con fiori
• Il differenziamento del callo dipende dal
rapporto tra 2 ormoni, le citochinine e le
auxine. Quando il rapporto aux/cit è alto si
sviluppano radici…
Rigenerazione di piante da
protoplasti
Trasformazione di cellule
vegetali
• Le cellule vegetali mature sono circondate
da una parete cellulare costituita da
cellulosa, emicellulosa, pectina e lignina e
quindi non sono molto idonee alla captazione
del DNA
• La parete cellulare può essere rimossa
mediante degli enzimi litici
• I protoplasti, cellule vegetali senza parete,
possono acquisire macromolecole come il
DNA e sono capaci di rigenerare piante
intere
Esempio di trasformazione
• Da foglie di tabacco vengono prelevati dei
dischi fogliari
• Le cellule al margine del disco cominciano a
rigenerare e se vengono messe in presenza
di A. tumefaciens possono essere
facilmente trasformate
• Le cellule che recano il plasmide vengono
selezionate coltivandole nel terreno
stimolatore di germogli e in presenza di un
antibiotico appropriato quale la kanamicina
(NPTII) e il cefotaxime che serve per
bloccare la proliferazione del A.
tumefaciens
Rigenerazione di dischi fogliari
Altri metodi per inserire
DNA in pianta
• Virus
– I virus si sono adattati nell’evoluzione a
trasferire il proprio genoma negli organismi
ospite
– Possono essere usati sia su dicotiledoni che su
monocotiledoni
– Contengono 2 filamenti di DNA a singola elica il
DNA A (contiene geni per la costruzione del
capside) e il DNA B (contiene i geni per la
virulenza)
Infezione sistemica
Altri metodi per inserire
DNA in pianta
• Elletroporazione
– Un’alta concentrazione di DNA plasmidico
contenente un gene clonato viene aggiunta a una
sospensione di protoplasti e il miscuglio viene
sottoposto a shock con campo elettrico che va
da 200 a 600 V/cm
– In seguito a elettroporazione i protoplasti
vengono fatti crescere in colture tissutali per
una o due settimane prima di iniziare la
selezione dei cloni positivi
Altri metodi per inserire
DNA in pianta
• Gene Gun
– Sferette di tungsteno rivestite di DNA vengono
sparate direttamente nelle cellule vegetali.
– I bersagli finora scelti includono
• Sospensioni di cellule embrionali
• Foglie intattte
• Semi
– Il bombardamento può produrre organuli
transgenici
• Cloroplasti
• mitocondri
Gene Gun-1
Gene Gun-2