3a LEZIONE PATOLOGIA CLINICA 8 marzo 2016
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EMOPOIESI L’emopoiesi rappresenta l’insieme dei processi cellulari tesi alla formazione degli elementi figurati del sangue. L’ENTITA’ DEL FENOMENO EMOPOIESI In condizioni normali, ogni ora sono prodotti: 1010 globuli rossi 109 globuli bianchi 24 ore/24 per tutta la vita In condizioni di stress (perdita acuta di sangue, infezione) i fabbisogni aumentano di 10 volte e oltre Inoltre le cellule prodotte dal midollo sono in grado di funzionare in tutti i distretti dell’organismo in modo autonomo Nei vertebrati lo sviluppo delle cellule del sangue avviene in due fasi: una fase embrionale transitoria e una successiva fase definitiva. Queste fasi differiscono per i siti in cui gli elementi del sangue vengono prodotti, per la tipologia delle cellule prodotte e per i tempi necessari all’emopoiesi. L’emopoiesi prenatale è, a sua volta, suddivisa in 4 fasi: PRENATALE POSTNATALE CELLULARITA' (%) 100 MIDOLLO OSSEO SACCO VITELLINO Epatica VERTEBRE Mieloide FEGATO 80 Mesoblastica 60 STERNO Splenica 40 MILZA COSTOLE TIBIA 20 0 FEMORE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NASCITA 20 30 40 ETA' 50 60 70 Periodo epato-splenico (12a settimana) Umbilical cord Spleen Adult bone marrow Fetal liver Yolk Sac Periodo mesoblastico (sacco vitellino) Periodo epatico (6a settimana) Periodo midollare (20a settimana) Ontogenesi dell’Emopoiesi SITI DELL’EMOPOIESI Feto Bambini Adulti 0-2 mesi Sacco Vitellino (mesoblastica) 0-8 mesi Fegato, Milza 5-9 mesi Midollo Osseo (epatica, splenica) (mieloide) Il midollo osseo rosso si trova in tutte le ossa (canale midollare) fino alla pubertà, poi viene lentamente sostituito da midollo osseo giallo Il midollo osseo rosso, attivo, si trova soprattutto nelle estremità delle ossa lunghe , fra i due tavolati delle ossa piatte (sterno, coste, scapole) e a livello delle ossa del bacino. Adulto Bambino MIDOLLO OSSEO Il midollo osseo si situa nelle nicchie delimitate dalle trabecole della spongiosa ossea. Il midollo osseo è un tessuto da gelatinoso a semifluido. TESSUTO EMOPOIETICO Nella cavità del tessuto spugnoso e nella cavità midollare è contenuto il midollo osseo rosso, con funzione emopoietica, e il midollo osseo giallo (prevalentemente cellule adipose) CELLULE STAMINALI Sono cellule non specializzate caratterizzate da due fondamentali proprietà che le definiscono e differenziano da tutte le altre cellule: - La capacità di autorinnovarsi mediante divisioni cellulari da cui si originano cellule identiche alla cellula madre - La capacità di differenziare dando origine a cellule specializzate TOTIPOTENTI - PLURIPOTENTI MULTIPOTENTI UNIPOTENTI + DIFFERENZIAMENTO CLASSIFICAZIONE DELLE CELLULE STAMINALI CELLULE STAMINALI LE CELLULE STAMINALI • CELLULE CAPACI DI DIVIDERSI (AUTORINNOVAMENTO) PER TUTTA LA VITA DI UN ORGANISMO • IN DETERMINATE CONDIZIONI SONO IN GRADO DI DIFFERENZIARSI DANDO ORIGINE ALLE CELLULE MATURE DI UN ORGANISMO; • IN BASE AL POTENZIALE DIFFERENZIATIVO POSSONO ESSERE DISTINTE IN: TOTIPOTENTI LO ZIGOTE (UOVO FECONDATO) PLURIPOTENTI LE CS EMBRIONALI (da cui deririvano le cellule del MESODERMA ECTODERMA, ENDODERMA) MULTIPOTENTI LE CS DELL’ADULTO PROPRIETA’ DELLA CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA: • capacità di “self-renewal” • capacità di dare origine a progenitori multipotenti • capacità di dare origine a precursori “committed” (differentiation plasticity) • Capacità di engraftment • Plasticità (developmental plasticity) La cellula staminale emopoietica PLASTICITA’ DELLE CELLULE STAMINALI MICROAMBIENTE MIDOLLARE Componente cellulare Componente vascolare Cellule reticolari (istiociti) Struttura nervosa Adipociti, fibroblasti, Macrofagi Cellule stam. mesenchimali Matrice extracellulare Fibre reticolari/collagene Prolungamenti cell. reticolari Proteine d’adesione proteoglicani IL MICROAMBIENTE EMOPOIETICO Il microambiente (nicchia emopoietica) è composto da una multitudine di cellule stromali ed emopoietiche che forniscono: Superfici Matrice extracellulare Fattori solubili che in concerto sono responsabili della regolazione e proliferazione, quiescenza, differenziazione, reclutamento ed accumulo dei progenitori emopoietici e delle cellule staminali. Le funzioni della nicchia emopoietica sono diverse: Fornire uno spazio anatomico Istruire le cellule ad autorinnovarsi (stretto rapporto con il microambiente) o a differenziarsi (lontano dalle cells stromali) Influenzare la mobilità cellulare. STRUTTURA DEL MIDOLLO OSSEO Cavità compartimentalizzate da trabecole ossee, contenenti cellule stromali (adipociti, fibroblasti, macrofagi) e cellule emopoietiche (eritroblasti, granuloblasti, megacariociti), con un complesso sistema vascolare (arteriole midollari e corticali, rete sinusale, seno centrale) ed una specifica matrice extracellulare che fornisce una rete strutturale a cui le cellule stromali ed emopoietiche possono ancorarsi. VASCOLARIZZAZIONE Il sistema vascolare è permeabile alle cellule ematiche mature per la presenza di pori di migrazione beanti sulla parete sinusale (passaggio per processo "attivo"). MIDOLLO OSSEO IMMISSIONE IN CIRCOLO DEGLI ELEMENTI MATURI La normale funzione del midollo dipende da: 1. Normalità del microambiente midollare specifico 2. Normale funzione delle CELLULE STAMINALI 3. Vit. B12, acido folico, ferro+ormoni, proteine+lipidi +zuccheri CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE Circa lo 0.1% di cellule nucleate del midollo sono quiescenti e considerate pluripotenti. Per mitosi generano una cellula pluripotente (autorinnovamento) e una cellula staminale dalle quali origineranno le cellula progenitrici (multipotenti) - CFU-GEMM precursore della linea mieloide - CFU-Ly precursore della linea linfoide CFU= unità formanti colonie Fasi dell’emopoiesi Cellula Staminale Automantenimento Orientamento Mieloide Linfoide DIFFERENZIAZIONE Eritroblasti Granuloblasti Megacariociti B T Monoblasti MATURAZIONE linfociti eritrociti granulociti monociti piastrine B maturi T maturi QUALI SONO I FATTORI CHE FAVORISCONO L’EMOPOIESI? - Il microambiente che si forma in nicchie specifiche adatte al differenziamento delle diverse linee ematiche - Il contatto con la matrice extracellulare - I fattori di crescita emopoietici I FATTORI DI CRESCITA I fattori di crescita sono glicoproteine prodotte dalle cellule stromali, dalle stesse cellule emopoietiche, dal fegato e dal rene. Funzioni: - Sono stimolatori dell’emopoiesi per il continuo rinnovo delle cellule ematiche (condizioni normali) - Stimolano la produzione di leucociti, eritrociti e piastrine in caso di infiammazione, anemia, trombocitopenia (condizioni di stress) LE CELLULE MESENCHIMALI (STROMALI) Fibroblasti, mio-fibroblasti, adipociti, osteoblasti, cellule endoteliali e macrofagi Citochine solubili Osteoblasti Cellula staminale Macrofago Fibroblasti Citochine di membrana Cellula endoteliale CSF,HGF, ILs Trabecola ossea SINTESI ED EFFETTI Molte citochine sono prodotte dalle cellule stromali del midollo ; agiscono a livello midollare e spesso anche in siti ben precisi e specifici. I fattori di crescita agiscono: - inducendo la proliferazione dei progenitori emopoietici - attivando le cellule mature - stimolando le funzioni delle cellule mature - stimolando la produzione di altri HGF CSF, HFG, IL - Il termine Colony Stimulating Factor (CSF) è un termine generico utilizzato per indicare sostanze capaci di stimolare la crescita di colonie ematopoietiche - Il termine Hematopoietic Growth Factor (HGF) indica specifici fattori capaci di agire a diversi livelli. - Il termine Interleukina (IL), originariamente indicava molecole che erano necessarie per le interazioni fra cellule dell’immunità. Oggi con questo termine si indica una classe di molecole attive nella cascata emopoietica, appartenenti alla famiglia delle citochine., che agiscono soprattutto sui leucociti. PRODUZIONE ENDOGENA La EPO fornisce l’esempio più chiaro per quanto riguarda la produzione endogena di fattori emopoietici, in quanto si conosce il sito esclusivo di produzione (apparato iuxtaglomerulare del rene) La TPO fornisce un altro esempio riguardante il rapporto fra livelli sierici e produzione di piastrine ed è la citochina regolatrice della produzione piastrinica (sintetizzata soprattutto dal fegato). EPO: eritropoietina TPO: trombopoietina Emopoiesi patologica In presenza di patologie, i siti extramidollari possono servire come siti primari per lo sviluppo delle cellule ematiche a. Siti ematopoietici fetali (milza e fegato) possono diventare siti primari nell’adulto in alcune malattie (anemia mediterranea) milza fegato b. Siti midollari adulti, che sono normalmente non ematopoietici (cervello, polmoni, esofago), possono trasformarsi in siti ematopoietici per aumentare la produzione di cellule del sangue o per presenza di malattie neoplastiche esofago polmone cervello EMOPOIESI Il midollo osseo è sede prevalentemente di proliferazione e maturazione delle cellule del sangue , ma può fungere anche da deposito. Infatti: Granulociti: il midollo funge da compartimento di proliferazione e maturazione ma anche da deposito midollo sede di maturazione e deposito Eritrociti: nel midollo avviene la maturazione ma non il deposito di globuli rossi perché la loro funzione è di agire da vettori di ossigeno e anidride carbonica midollo come sito di maturazione, non di deposito Megacariociti: nel midollo c’è la maturazione. Il 70% delle piastrine circola nel sangue, il restante 30% è depositato nella milza, fegato midollo come sito di maturazione, non di deposito VIA LINFOIDE La produzione dei linfociti inizia nel midollo osseo con la differenziazione verso la linea linfoide delle cellule staminali emopoietiche multipotenti, dalle quali derivano tutte le cellule del sangue. Si formano dapprima i progenitori linfoidi precoci, dei quali un’aliquota permane nel midollo osseo dove compie il processo maturativo che porta alla formazione dei linfociti B, mentre un’altra aliquota abbandona precocemente il midollo per raggiungere, per via ematica il timo dove ha inizio e si conclude la maturazione dei linfociti T. VIA MIELOIDE Eritropoiesi Mielopoiesi Trombopoiesi eritrociti leucociti piastrine ERITROPOIESI Gli eritrociti maturano in sei giorni, permangono in circolo come reticolociti per due giorni e circolano nel sangue per centoventi giorni. Durante la maturazione, il globulo rosso diventa sempre più piccolo in volume e il nucleo da grosso scompare per frammentazione (all’osservazione sembra che all’interno della cellula ci sia un “reticolo”), venendo poi espulso. Durante la maturazione agiscono: Fattore delle cellule staminali (SGF) IL3 e IL9 Eritropoietina ERITROPOIETINA ERITROPOIESI Dalla citologia midollare: Proeritroblasto Eritroblasto basofilo aumenta la sintesi di emoglobina (Hb) colorazione rosata del citoplasma Eritroblasto policromatofilo nucleo picnoticomasserelle Eritroblasto ortocromatico (ammassamento materiale nucleare, emoglobinizzazione del citoplasma) espulsione nucleo Reticolocita, dimensioni > della cellula matura, con residui citoplasmatici di RNA ribosomiale (policromasia=diffusa colorazione grigiastra o bluastra), frammenti di ribosomi e altri organelli. Completa eliminazione dei residui avviene parte nel midollo osseo e parte nella circolazione. I globuli rossi normali trascorrono in circolo 1-2gg in forma di reticolociti e 120gg in forma di eritrociti maturi. CFU-E EPO CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI I reticolociti possono essere misurati manualmente o automaticamente. Nel metodo manuale lo striscio di sangue viene colorato con un colorante sopravitale (blu di metilene) che mette in risalto il RE che persiste all’interno dei reticolociti. I metodi automatici sono più accurati perché possono contare più cellule. Un campione di sangue viene trattato con un particolare colorante e passato attraverso uno strumento che conta le cellule e le caratterizza utilizzando un laser. La diffusione della luce viene usata per contare i reticolociti. VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELL’ERITROPOIESI CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI (valutazione eritropoiesi) Il conteggio dei reticolociti è un importante indicatore dell’attività eritropoietica del midollo. Conteggio reticolociti osservato (CO): 0.5-2.5% dei globuli rossi circolanti. Nei neonati 2-6%. In condizioni di funzionalità midollare normale e adeguate riserve di ferro reticolocitosi è proporzionale alla perdita di sangue o distruzione dei globuli rossi. Valutazione di emorragie: Un episodio emorragico singolo causa reticolocitosi che inizia entro 24-48h e raggiunge un picco a 4-7gg, quando l’Hb si stabilizza si ritorna a livelli normali. Reticolocitosi persistente indica una perdita di sangue continua o ricorrente. Il conteggio dei reticolociti è importante nella: Diagnosi differenziale delle anemie Es. reticolocitosi come test per valutare carenza vitamina B12: se somministrazione di dosi fisiologiche di B12 non induce reticolocitosi non c’e carenza di B12 Es. anemia perniciosa e talassemia, eritropoiesi inefficace: popolazione eritroide iperplastica, ma conteggio reticolociti basso perché le cellule non maturano mai a sufficienza per entrare in circolo. Valutazione della risposta alla terapia Marziale (anemia da carenza di ferro): reticolocitosi indica che il midollo sta rispondendo con un’aumentata produzione di eritrociti. MIELOPOIESI GM-CSF G-CSF M-CSF GRANULOPOIESI I globuli bianchi impiegano 14 giorni per la maturazione (durante la quale passano attraverso le fasi di mielobla sto, promielocita, mielocita, metamielocita, granulocita) Vivono per 6-8 giorni, poi raggiungono il tessuto connettivale per due giorni. I globuli bianchi nello striscio midollare sono più grandi dei globuli rossi, il citosol è roseo e il nucleo è polilobato (più la cellula invecchia più il nucleo si frammenta). La formazione di granulociti neutrofili, eosinofili e basofili è influenzata da: G-CSF IL1, IL5, IL6 GRANULOCITI: neutrofili eosinofili e basofili. Il > impegno della mielopoiesi è diretto vs la produzione della serie neutrofila, che, tra i leucociti circolanti, rappresenta numericamente la prima popolazione cellulare. Granulopoiesi : Pool proliferante o mitotico: mieloblasti promielociti mielociti Pool maturativo : metamielociti cellule a banda Pool di deposito (10gg): neutrofili Pool circolante (50%) Pool marginato (strettamente aderente alla parete dei piccoli vasi). Normalmente non più del 5% dei granulociti circolanti è immaturo e la grande maggioranza di queste cellule si trova nel penultimo stadio di maturazione (cellule a banda). MIELOPOIESI G-CSF MIELOPOIESI M-CSF MONOCITI Nel midollo i precursori dei monociti sono generalmente poco numerosi. Stimolati da M-CSF: Monoblasto promonocita monocita maturo. I monociti rimangono in circolo 12-14 ore prima di migrare nei tessuti e diventare macrofago. nei tessuti TROMBOPOIESI I megacariociti sono i precursori delle piastrine circolanti e rappresentano la cellula del midollo di maggiori dimensioni. - Trombopoietina controlla la loro proliferazione e maturazione. - Durante la maturazione il nucleo va incontro a successive divisioni non seguite dalla divisione cellulare cellula plurinucleata. Successivamente la formazione di membrane di demarcazione all’interno del citoplasma separa le singole piastrine che vengono rilasciate in circolo: 1 megacariocita molte migliaia di piastrine. - Il numero di piastrine circolanti è mantenuto entro ristretti limiti di variazione e sembra controllato dalla massa totale di piastrine nell’organismo e dal rilascio di trombopoietina. TROMBOPOIESI Trombopoietina TROMBOPOIESI - Ciascun megacariocita durante la sua vita genera circa 4.000 - piastrine Le piastrine vivono mediamente 10-12 giorni Ogni giorno vengono prodotte 30.000-40.000 piastrine/mmc Se necessario, la loro produzione può aumentare anche di 8 volte Dopo 10-12 giorni vengono fagocitate dal sistema reticolo/endoteliale di milza e fegato EMIVITA DELLE CELLULE DEL SANGUE ERITROCITI 120 giorni PIASTRINE 4-5 giorni GRANULOCITI MONOCITI LINFOCITI 6-8 ore 8 ore VARIABILE VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELL’EMOPOIESI ASPIRATO MIDOLLARE Permette di apprezzare i dettagli, i rapporti reciproci e gli aspetti maturativi delle cellule midollari. Prelievo per aspirazione di piccolo quantitativo di materiale midollare della cavità midollare dalla cresta iliaca o dalla sterno e allestimento di uno striscio (Colorazione di Wright-Giemsa). Se non si riesce ad ottenere materiale dall’aspirazione: -attività emopoietica depressa (aplasia midollare); -il midollo contiene cellule molto immature, stipate, viscose (leucemia acuta); -fibrosi o metastasi midollari. BIOPSIA MIDOLLARE Prelievo di piccolo campione (cilindro) di tessuto midollare in genere dalla cresta iliaca. Permette di ottenere importanti informazioni sulla struttura del tessuto osseo e delle cellule tra di loro e con gli altri elementi del tessuto connettivale. ASPIRATO MIDOLLARE L’aspirato midollare nell’adulto è ormai quasi sempre eseguito a livello della cresta iliaca posteriore L’aspirato sternale, un tempo diffuso, è stato quasi del tutto soppiantato dall’aspirato dalle spine iliache posteriori superiori Dove effettuare l’aspirato midollare Sterno Cresta iliaca Tibia ASPIRATO MIDOLLARE vetrino Dall’aspirato midollare si ottengono le seguenti informazioni: -quantità totale di cellule; -sequenza maturativa delle cellule della via eritro- e mielo-poietica. -conta differenziale. Variazioni della distribuzione dei vari tipi cellulari del midollo con l’età; -rapporto mielo-eritrocitario (ME); -presenza di anormalità citologiche: presenza di tipi cellulari rari (mast cells, osteoblasti, osteoclasti…), di cellule anormali (cellule neoplastiche metastatiche) o anormalità di maturazione. -elementi meno abbondanti del midollo (es. megacariociti, linfociti e plasmacellule); -depositi di ferro (test di Pearls). BIOPSIA MIDOLLARE La biopsia osteomidollare è un tipo di indagine invasiva che permette di ottenere un frustolo di midollo emopoietico circondato da lamelle ossee. Il campione bioptico viene processato mediante fissazione/decalcificazione, inclusione e sottoposto a sezione. Le sezioni ottenute sono altamente rappresentative della struttura midollare BIOPSIA MIDOLLARE Dalla biopsia midollare si ottengono le seguenti informazioni: - valutazione della cellularità e della sua distribuzione nel contesto del midollo - valutazione dell’architettura dell’osso - puntio sicca al mieloaspirato - ricerca di metastasi occulte L’aspirato midollare da informazioni migliori della biopsia nella diagnostica delle leucemie acute, delle mielodisplasie e di diversi tipi di anemie, questo perché fornisce dettagli morfologici sulle singole cellule, più precisi rispetto alle sezioni bioptiche. Aspirato midollare Biopsia midollare VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELL’EMOPOIESI rapporto tra cellule emopoietiche in via di dfr e tessuto adiposo midollare. Parametro relativamente costante 1:1 – 2:1 tra cellule e grasso. Se > 1:1 – 2:1 indice di ipercellularità. Natura della linea cellulare più rappresentata fornisce importanti indicazioni sulla malattia in atto. La cellularità midollare varia a seconda dell’età del soggetto e della sede del prelievo. CELLULARITA’ MIDOLLARE = RAPPORTO MIELO-ERITROCITARIO (ME, valori normali 2:1-4:1) Il sangue circolante contiene circa 1000x di più globuli rossi che bianchi, mentre nel midollo le cellule nucleate della serie bianca sono più numerose di quelle nucleate della serie rossa con un rapporto di 3:1 (valori normali 2:1-4:1). Il rapido ricambio di granulociti, la persistenza del nucleo in queste cellule ed il fatto che cellule mieloidi mature vengano trattenute nel midollo spiegano perché all’esame del midollo la maggior parte delle cellule nucleate appartengano alla serie mieloide. ASPIRATO MIDOLLARE Granulocita Leucemia acuta Aspirato normale BIOPSIA MIDOLLARE Midollo osseo normale BIOPSIA MIDOLLARE Midollo osseo iperplastico Midollo osseo aplastico Midollo osseo nell’anemia aplastica
