diapositive "Le biotecnologie"

Le biotecnologie
- Mezzo secolo di biologia
- I fondamenti
- Gli strumenti attuali più importanti
- Gli ambiti applicativi
- Le prospettive e gli interrogativi
Mezzo secolo di biologia
1944 Hershey e Martha Chase studiando virus batterici, e Avery occupandosi di batteri
patogeni, dimostrano che il DNA è materiale genetico in grado di trasferire
caratteristiche metaboliche da un organismo all’altro.
1953 Watson e Creek determinano la struttura del DNA
1961 Niremberg decifra il codice genetico
1973 Boyer e Cohen fondano la tecnologia del DNA ricombinante
1976 Maxam e Gilbert e in un altro laboratorio Sanger mettono a punto 2 diversi metodi
per sequenziare il DNA. Il metodo di Sanger, automatizzato, è tuttora utilizzato
1978 Genentech produce insulina umana ricombinante in E.coli
1982 Primo vaccino animale prodotto con tecnologie ricombinanti introdotto in UE
1983 Impiego di un vettore per il trasferimento di geni esogeni nelle piante
1988 Reazione a catena della polimerasi (PCR)
1990 Inizio del Progetto Genoma Umano
1996 Sequenziamento completo del genoma di S. cerevisiae
1997 Clonazione di un mammifero (Dolly)
2000 Annuncio della conclusione Sequenziamento Genoma Umano
Le biotecnologie
- Mezzo secolo di biologia
- Conoscenze e proprietà fondanti
- Gli strumenti attuali più importanti
- Gli ambiti applicativi
- Le prospettive e gli interrogativi
1953 il DNA: la
Doppia Elica di Watson e Creek
Grazie agli studi di diffrazione ai raggi X, che molto probabilmente segnarono il destino di
Rosalind Franklin, Watson e Creek risolvono l’enigma di una molecola
sorprendentemente ordinata e geometrica.
Il concetto di
Complementarietà…
La denaturazione di una molecola di DNA
rompe i ponti H tra le basi azotate:
Si liberano due eliche COMPLEMENTARI.
…e il concetto di
Ibridazione
Tratti anche piuttosto lunghi (diverse decine di pb) di DNA a singola elica di qualunque
provenienza, anche artificiale, si IBRIDANO facilmente ad un’elica di DNA costituita dalla
sequenza complementare. Si forma una doppia elica corretta.
La genetica di
Escherichia coli
Colonia di Escherichia coli
Il DNA di un batterio è raccolto in un unico cromosoma
circolare. In alcune situazioni specifiche, un tratto di DNA può
essere scambiato e trasferito come caratteristica fenotipica da un
organismo ad un altro uguale, ricordando il concetto Mendelliano
di trasmissione di un GENE.
E. coli talvolta
si trova su brevi sequenze circolari: i Plasmidi
Una parte del DNA in
Cromosoma
(4.5 Mb)
Trasformazione
Plasmide
(~2-100 kb)
plasmide
Molti batteri, come E. coli, possono essere dotati anche di un DNA circolare a doppia elica,
molto più piccolo del cromosoma (~1:1000): il plasmide.
Può essere presente anche in numerose copie. In condizioni favorevoli opportune, un
plasmide libero entra con facilità in un batterio e può anche successivamente uscirvi.
Le funzioni del DNA
Plasmidico
Esistono moltissimi tipi di plasmidi, con proprietà
diverse. In generale le loro attività naturali possibili
sono le seguenti:
- si replicano e segregano alla divisione (anche se
non sempre)
- spesso portano 1 o più geni per resistenze ad
antibiotici
- possono portare anche geni metabolici ed
esprimerli
- possono ricombinare con il cromosoma batterico
e scambiare tratti di DNA
- possono trasferirsi in atri batteri per
“coniugazione batterica” attraverso i pili
- possono comportarsi da vettori di DNA
cromosomico trasferendone dei brevi tratti in un
altro batterio.
Proteina
Gli enzimi di
Restrizione
I batteri possiedono enzimi deputati alla digestione di DNA estraneo, ad esempio
virale, i quali non tagliano a caso, ma riconoscono sequenze specifiche di basi
azotate. Oggi se ne conoscono più di cento.
Filamenti diversi di DNA, tagliati da un enzima di restrizione che genera estremità di
taglio sfalsate (“coesive”), possono ibridare e legarsi.
Le potenzialità di questo “taglia e cuci” sono enormi.
5’
3’
Regione
taglio sfalsato
Regione del
di riconoscimento
3’
5’
EcoRI riconosce la sequenza GAATTC e taglia DNA in quel punto,
generando 2 frammenti di DNA.
La
Ricombinazione omologa
Il DNA possiede la capacità di ibridarsi a regioni di DNA omologo per
semplice affiancamento. Il termine RICOMBINAZIONE è ripreso dal
concetto classico Mendelliano.
La prima evidenza al microscopio fu quella dei chiasmi del crossing-over
della meiosi, ma il fenomeno si era già reso noto in termini teorici studiando
il comportamento dei plasmidi batterici.
La
Ricombinazione omologa
DNA esogeno
DNA genomico
Tratti di DNA omologo possono ricombinare fra loro e consentire lo scambio di
sequenze d’interesse
L’
Analisi dei frammenti di DNA
- Il DNA è carico negativamente
- Corso su un gel di agarosio in un campo elettrico si separa in base alla lunghezza del
frammento o al suo grado di avvolgimento
- Le basi vengono regolarmente intercalate da EtBr che è visibile in luce UV
La
PCR: la Reazione di polimerizzazione
a catena:
Animazione
Vengono sfruttate le seguenti proprietà:
- Condizioni di lavoro semplici dell’enzima DNApolimerasi
- Notevole velocità di reazione (anche centinaia bp/sec)
- Innesco di lavoro dell’enzima basato su brevi sequenze “primer”
- Separazione delle doppie eliche per denaturazione
Le biotecnologie
- Mezzo secolo di biologia
- Le proprietà fondanti
- Gli strumenti attuali più importanti
- Gli ambiti applicativi
- Le prospettive e gli interrogativi
Il DNA
Ricombinante
Taglio dell’enzima
di restrizione
A: plasmide tagliato
B: gene esogeno tagliato con lo stesso enzima
C: inserzione del gene
Gli
Inserti e il Clonaggio genico
Il termine di DNA ricombinante ha origine sempre dal concetto di ricombinazione genica.
Qui si tratta di una ricombinazione per inserzione.
All’interno dei plasmidi, un gene esogeno di qualunque provenienza, può essere
clonato e replicato in colture batteriche.
Il gene può essere inserito a valle di sequenze batteriche promotore, anche inducibili, e
portare all’espressione di proteine di qualunque altro organismo all’interno del
batterio.
Le
Banche geniche
Le
Banche di Plasmidi e di Fagi
I singoli cloni di DNA genomico vengono
riconosciuti da piccole sonde nucleotidiche
di sequenza nota, marcate e rintracciabili
Le banche di
mRNA
cDNA da estratti cellulari di mRNA
7-mG
AAAAA-3’
Oligo (dT)
TTTTT
7-mG
Trascrittasi inversa
dATP, dCTP, dTTP, dGTP
7-mG
AAAAA-3’
TTTT-5’
OH-3’
7-mG
Frammento di Klenow
dATP, dCTP, dTTP, dGTP
AAAAA-3’
TTTT-5’
Rnasi H
Nucleasi S1
TTTT-5’
DNA complementare (cDNA)
AAAAA-3’
TTTT-5’
OH
La Trascrittasi inversa è un enzima
scoperto nei retrovirus.
Questo enzima consente di ottenere DNA
complementare al mRNA.
Vantaggi del cDNA:
- è un gene funzionante sotto qualunque
promotore
- è composto solo da esoni
I nuovi
Micro Array: un’evoluzione
Si tratta di prodotti soprattutto “commerciali”:
- Banche di cDNA, relative a organismi o a tessuti, predisposte su microchips di pochi cm
- Vengono fatte ibridare a cDNA provenienti da mRNA estratti da cellule o altro
- Indicano in tempi brevissimi l’induzione di determinati geni in condizioni specifiche
- Sono supportati da una rapidissima analisi informatica
Le proteine
Ricombinanti (OGM a tutti gli effetti!)
L’
Espressione di proteine ricombinanti
La
Trasfezione cellulare
Proteina
cell
Trasfezione del costrutto
mRNA
Inibizione
L’
dell’espressione genica
(il silenziamento)
cell
Trasfezione del costrutto antisenso
(la trascrizione di questo gene produce un mRNA as)
RNA-antisenso
mRNA
mRNA prodotto dal nucleo di una cellula eucariote
DEGRADAZIONE
Gli
Small Interfering RNA (siRNA)
siRNA
È un altro tipo di Silenziamento
Basato su un meccanismo fisiologico recentemente scoperto, in cui gli siRNA
dirigono il riconoscimento e la degradazione di mRNA da parte di un
enzima specifico effettuando una regolazione negativa.
Il
Sequenziamento del DNA
Il
Sequenziamento di un genoma
Sequenziare un genoma non significa conoscere il funzionamento di ogni gene
Offre l’opportunità di rintracciare quelli di cui possediamo qualche evidenza
La Ricostruzione della sequenza
La ricostruzione della sequenza viene effettuata grazie all’uso di
enzimi di restrizione diversi
I
Marcatori molecolari
Vi sono approcci di analisi del DNA in grado di
mettere in evidenza caratteristiche degli individui altrimenti invisibili:
- Mutazioni
- Associazioni a caratteristiche fenotipiche specifiche
- Attribuzione di paternità o parentela
- Un’ “impronta digitale” inconfondibile
Sono basati sugli effetti in larga scala di tagli enzimatici di restrizione
o di amplificazioni di sequenza
Un punto del genoma in
grado di rendersi evidente
solo in casi specifici
È un marcatore molecolare
Se fossimo ciechi e sordi e
dovessimo trovare un asino in
mezzo a dei cavalli, avremmo a
disposizione almeno 3 “marcatori”:
la lunghezza del pelo, l’altezza al
garrese e la lunghezza delle
orecchie!
Le biotecnologie
- Mezzo secolo di biologia
- Le proprietà fondanti
- Gli strumenti attuali più importanti
- Gli ambiti applicativi
- Le prospettive e gli interrogativi
La
Cura e la Prevenzione di Malattie
Le proteine ricombinanti possono essere usate come farmaci
(insulina) e consentono la produzione in larga scala di anticorpi
sempre ad impiego farmacologico:
- Contro tumori
- Contro malattie degenerative
La diagnosi genetica molecolare consente di individuare
precocemente molte malattie, compreso i tumori
L’impiego di marcatori molecolari consente di eliminare i dubbi
sulla presenza di certe alterazioni genetiche
La codifica del nostro
Genoma
1999 (Dicembre) Pubblicata su Nature la sequenza completa del cromosoma 22.
2000 (Maggio) pubblicata su Nature la sequenza completa del cromosoma 21.
2000 (Giugno) Francis Collins e Craig Venter annunciano congiuntamente di aver
completato la "bozza" del genoma Umano.
2001 La bozza completa del genoma umano (che gli inglesi chiamano working
draft) è pubblicata su Nature (quella del consorzio pubblico)
e su Science (quella della Celera).
Il
Miglioramento genetico di piante (e animali)
Stato
Milioni di ha
% di ogm
prodotti
Coltivati con OGM
USA
49,8
55,3
Soia,mais,cotone,zucca,colza
Argentina
17,1
19
Soia, mais, cotone
Brasile
9,4
10
Soia
Canada
5,8
6,4
Colza, mais, soia
Cina
3,3
3,6
Cotone
Paraguay
1,8
2
Soia
India
1,3
1,4
Cotone
Sud Africa
0,5
0,5
Mais, soia, cotone
Uruguay
0,3
0,3
Soia, mais
Australia
0,3
0,3
Cotone
Romania
0,1
0,1
Soia
MessicoFino ad oggi, nell’impiego
0,1
0,1 vegetali (VGM), non
Soia,
cotone
di OGM
si sono
ancora
Spagna
0,1di tipo ambientale. Le paure
Maisriguardo al
verificati danni,0,1
né alla salute, né
futuro per0,1
ora sono solo ascrivibili
ad oggettive speculazioni.
Filippine
0,1
Mais
TOTALE
90 milioni di ha
100 %
Gli animali
Transgenici
Gli organismi animali transgenici possono essere ottenuti modificando
cellule embrionali totipotenti
Esempio: generazione di topi transgenici mediante microiniezione di DNA
nei pronuclei maschili
La
Clonazione degli animali
Le biotecnologie
- Mezzo secolo di biologia
- Le proprietà fondanti
- Gli strumenti attuali più importanti
- Gli ambiti applicativi
- Le prospettive e gli interrogativi
Le Terapie geniche
Il silenziamento o la supplementazione dei geni in tessuti malati
offre possibilità di applicazione davvero enormi
- Contro tumori
- Contro malattie degenerative
Cellule malate potrebbero essere prelevate da tessuti malati,
modificate geneticamente e reimpiantate
Anche cellule embrionali potrebbero essere curate per
modificazione genetica e reimpiantate
L’uso delle cellule
Staminali a fini terapeutici
Riparazione di un tessuto
Eliminazione problemi di rigetto
La creazione di
Nuovi Organismi
Le caratteristiche genetiche di organismi utili all’uomo potrebbero
essere amplificate anche notevolmente
Recentemente è stato creato un riso ricco di vit. A e si sta
cercando di creare piante e microorganismi mangiatori di
sostanze di rifiuto o inquinanti
La manipolazione protratta e approfondita potrebbe consentire di
creare veri e propri nuovi organismi
L’uomo si
Interroga
• Il primo OGM moderno fu ottenuto nel 1973 da Stanley Cohen (Stanford
University School of Medicine) e Herbert Boyer (University of California, San
Francisco) che, grazie all'uso delle nuove tecniche di biologia molecolare
riuscirono per primi a clonare un gene in E. coli dimostrando che era
possibile trasferire materiale genetico da un organismo ad un altro tramite
l'utilizzo di vettori plasmidici in grado di autoreplicarsi, abbattendo di fatto le
barriere specie-specifiche.
• Alla luce della portata di tali risultati, nel 1974, la comunità scientifica si
autoimpose una moratoria internazionale sull'uso della tecnica del DNA
ricombinante per valutare la nuova tecnologia ed i suoi possibili rischi.
• Fino a che punto è lecita la manipolazione genetica dell’uomo?
• Quali scenari mostra la possibilità di clonare una persona?
Abbiamo realmente in mano
il
Segreto della Vita?