adenilato ciclasi attiva

DG>O
Non spontanee
DG<O
spontanee
Nelle cellule, le singole reazioni enzimatiche fanno parte di
sequenze a più tappe chiamate vie metaboliche.
In una via metabolica, il prodotto di una reazione funge da
substrato nella reazione successiva.
Si definisce
metaboliche.
metabolismo
l’insieme
Le vie metaboliche vengono classificate in:

- cataboliche (demolitive)

- anaboliche (sintetiche).
di
queste
vie
Le vie cataboliche

 Le reazioni cataboliche disgregano le molecole complesse (proteine,






polisaccaridi, lipidi) producendo poche molecole semplici come CO2,
NH3 ed H2O.
Servono a catturare, sotto forma di ATP, l’energia chimica liberata
dalla degradazione di molecole combustibili.
La liberazione di energia nella degradazione di molecole complesse
avviene in 3 stadi:
I) l’idrolisi delle molecole complesse
II) conversione
conversione dei
dei monomeri
monomeri in
in molecole
molecole più semplici
più semplici
II)
III) ossidazione
ossidazione dell’acetil
dell’acetil CoA
CoA
III)
Il catabolismo
catabolismo èè un
un processo
processo convergente
convergente (una
(una grande
grande varietà
varietà di
di
Il
molecole si
si trasforma
trasforma in
in pochi
pochi prodotti
prodotti finali
finali comuni).
comuni).
molecole
Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli
2
Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli
La regolazione del metabolismo
Le

Le vie metaboliche devono essere coordinate in modo
che la produzione di energia o la sintesi dei prodotti finali
rispondano ai reali bisogni delle cellule.

Le singole cellule non lavorano isolatamente ma fanno
Le
parte di una comunità di tessuti interagenti.

II
segnali
regolatori
comprendono:
neurotrasmettitori, disponibilità di nutrienti.
ormoni,
 I segnali che si generano all’interno di una cellula (segnali
intracellulari) producono risposte rapide e regolano istante per
istante il metabolismo.
 La segnalazione tra cellule (intercellulare) produce risposte più
lente. La comunicazione più importante è quella mediata da
ormoni o neurotrasmettitori.
 Il legame di un ormone o di un neurotrasmettitore ad un recettore
innesca una serie di reazioni che hanno come risultato finale una
specifica risposta intracellulare. I secondi messaggeri fanno parte
di questa cascata di eventi.
Adenilato ciclasi
Il sistema dell’adenilato ciclasi è particolarmente importante
nella regolazione delle vie del metabolismo intermedio.
Il legame di ormoni o neurotrasmettitori ai recettori specifici
innesca un aumento o una diminuzione dell’attività
dell’adenilato ciclasi.
L’adenilato ciclasi è un enzima legato alla membrana che
converte l’ATP in 3’,5’-adenosina monofosfato (AMP ciclico o
cAMP).
I recettori che agiscono attraverso l’adenil ciclasi hanno:
a) una regione extracellulare, che riconosce il ligando
b) 7 eliche transmembranali
c) un dominio intracellulare che interagisce con le proteine G.
Le proteine G

Sono proteine trimeriche localizzate nella membrana cellulare,
Sono
associate ai recettori.

Sono così chiamate perché legano i nucleotidi guanosinici (GTP e
Sono
GDP).

Sono il primo degli anelli di comunicazione tra recettore di
Sono
membrana ed adenilato ciclasi.

Normalmente sono in forma inattiva (proteina G legata al GDP).
Normalmente
IlIl recettore attivato (dal legame con un ormone o

neurotrasmettitore) interagisce con le proteine G scambiando il
GDP col GTP (proteina G attiva).
La proteina G attivata si dissocia nella subunità a e nel
dimero bg.
La subunità a si sposta verso l’adenil ciclasi,
attivandola.
Per ogni molecola di recettore attivato si formano
molte molecole di proteina G attiva.
L’azione del complesso proteina G-GTP è di breve
durata.
Le proteine G hanno un’attività GTPasica intrinseca,
che provoca l’idrolisi del GTP in GDP con conseguente
inattivazione della proteina G e dell’adenilato ciclasi.
Champe et al., Le basi della biochimica, Ed. Zanichelli
 La capacità di un ormone di stimolare o inibire
l’adenilato ciclasi dipende dal tipo di proteina G che si
trova legata al recettore.
 La famiglia delle proteine Gs è specifica per
l’attivazione dell’adenilato ciclasi mentre la famiglia
designata Gi provoca l’inibizione dell’enzima.
 Il complesso “proteina G-GTP” ha una breve durata: le
proteine G hanno attività GTPasica intrinseca
idrolisi del GTP in GDP
inattivazione
della
proteina G e dell’adenilato ciclasi.
Il cAMP attiva una famiglia di enzimi chiamati proteina chinasi
cAMP dipendenti .
Essi catalizzano il trasferimento del fosfato dall’ATP a specifici
residui di serina o treonina di substrati proteici.
Le proteine fosforilate possono agire direttamente sui canali ionici
della cellula oppure, se sono enzimi, possono essere attivati o
inattivati.
N.B. Non tutte le proteina chinasi dipendono dal cAMP (p.es. la
proteina chinasi C).
DEFOSFORILAZIONE DELLE PROTEINE
 Le variazioni delle attività enzimatiche indotte dalla fosforilazione delle proteine non
sono permanenti.
 Le proteina fosfatasi, enzimi che idrolizzano gli esteri fosforici, rimuovono i gruppi
fosfato aggiunti dalle proteina chinasi.
IDROLISI DEL cAMP
 Il cAMP è idrolizzato rapidamente a 5’-AMP dalla cAMP fosfodiesterasi, che rompe il
legame fosfodiestere ciclico 3’-5’ (il 5’-AMP non è una molecola di segnale).
 N.B. La fosfodiesterasi è inibita da derivati della metilxantina (teofillina e caffeina).
Metabolismo
meccanismi di regolazione
 Livelli di Enzima
 Attività Enzimatica
 Compartimentalizzazione cellulare
 Molecole trasportatrici
 Controllo ormonale
Completamente ossidato
Muscolo scheletrico
Periodi di bassa richiesta di E
Periodi di alta richiesta di Energia
(dal glicogeno)
≠
Muscolo cardiaco
Continua necessità di E per una
contrazione regolare: glucosio
completamente ossidato
G1P + UTP  UDPGlucosio (UDPG)
+ 2 NAD+
sintesi del glicogeno
UDP-Glucuronato
UDP-Glucuronato + R-OH  R-O-Glucuronato + UDP
Composti apolari coniugati con accettori non polari per formare composti più
polari
- composti endogeni: bilirubina, ormoni steroidei, T3
- composti esogeni: farmaci
LIVELLI DI CONTROLLO DEL METABOLISMO
IMMEDIATO non richiede energia
- flusso del substrato (controllato da Km)
- regolazione allosterica
prodotto (inibizione a feed back)
metaboliti
H+ ; Ca+2
A BREVE TERMINE (MINUTI) - RICHIEDE ENERGIA
modificazione covalente (fosforilazione - defosforilazione di proteine)
A LUNGO TERMINE (ORE) - RICHIEDE ENERGIA
Modificazione dei livelli proteici tramite
- biosintesi proteica
- degradazione proteica
Controllo della glicolisi
A BREVE TERMINE
- controllo allosterico
- ciclo dei substrati
A LUNGO TERMINE
- modificazione covalente
- modificazione dei livelli enzimatici
Controllo allosterico
Fosfofruttochinasi
ATP
 AMP  Ca2+
 CITRATO
 H+
 F2,6bisP (insulina)
 AMP
F1,6bisP fosfatasi
Glicogeno fosforilasi
ATP
 AMP
 G6P
Glicogeno sintasi
 ATP
 G6P
 F2,6BP
Ca2+
Controllo allosterico
e
Ciclo dei substrati
ATP 5 mM
AMP 0,1 mM
 10%
 600%
Muscolo
ATP/AMP  50
ATP/ADP  10
4,5 mM
0,6 mM
L’aumento dell’AMP comporta un
aumento di 10 volte dell’attività della PFK
contemporaneamente
calo di 10 volte della attività della fosfatasi
RISULTATO: aumento 100 volte del flusso glicolitico
Gli enzimi sono catalizzatori modulabili
Sintesi e degradazione della proteina
Stimolazione o inibizione da parte di:
piccole molecole (metaboliti, ioni)
grosse molecole (proteine, acidi nucleici)
Stimolazione o inibizione mediante modifiche
covalenti reversibili
Regolazione
Regolazione allosterica (positiva e negativa)
Regolazione per modificazione covalente (positiva
e negativa)
Non tutti gli enzimi sono di tipo michaeliano
Vmax
vo
concentrazione di S
in conclusione
controllo metabolico = controllo cinetico
controllo cinetico = controllo enzimatico
gli enzimi = catalizzatori modulabili
gli enzimi = sensori molecolari con
attività catalitica
Termodinamica
del metabolismo
Irreversibilità del processo
Reazione di controllo
Catabolismo e anabolismo usano vie diverse
Controllo del flusso metabolico
Controllo allosterico
modificazione covalente
vie metaboliche cicliche
controllo genetico
Principali vie del catabolismo
e compartimenti cellulari
SEGNALI CHIMICI EXTRACELLULARI
hanno un meccanismo generale comune
CONTROLLO ORMONALE
NEUROTRASMISSIONE
OLFATTO
GUSTO
VISTA
CRESCITA
DIFFERENZIAMENTO
NATURA CHIMICA degli ORMONI
POLIPEPTIDICA
insulina, glucagone,
ormoni ipofisari
paratormone
AMMINOACIDICA (dalla tirosina)
adrenalina, ormoni tiroidei
STEROIDEA
-composti lipofili,
- richiedono trasportatori ematici
- si legano a recettori intracellulari
ormoni sessuali
corticosurrenalici
1,25-diidrossi colecalciferolo o 1,25 (OH)2 D3
I recettori per gli ormoni steroideI formano eterodimeri con
RXR recettore per l’acido retinoico (derivato Vit A)
Extrac.
citoplasma
nucleo
RXR
Complesso
Trascrizione
coattivatore
basale
DNA
MECCANISMI DI
TRASDUZIONE DEL SEGNALE
DI ADRENALINA E DI
ORMONI POLIPEPTIDICI
(Glucagone)
I. SEGNALE: ORMONE
RECETTORE (membrana)
legame 1:1 R-ormone
II. TRASDUZIONE (membrana)
amplificazione del segnale tramite enzimi
proteine G, adenilato ciclasi, fosfolipasi C
III. SECONDI MESSAGGERI (citoplasma, membrana)
AMPc, Ca2+ , inositolo 1,4,5,trifosfato, diacilglicerolo
IV. PROTEIN CHINASI; FOSFOPROTEIN FOSFATASI
V. RISPOSTA CELLULARE
attivazione enzimi, fattori di trascrizione, canali di membrana
Recettore -adrenergico (R)
R + ormone  R..ormone
conseguente cambio
conformazionale del recettore
DISATTIVAZIONE (se permane il legame R..ormone)
1. la “chinasi del recettore -adrenergico” riconosce la forma attiva
2. il recettore viene fosforilato (R-P)
3. la proteina -arrestina lega il R-P
4. si interrompe l’interazione con le proteine G
Subunità : lenta attività
GTPasica (sec)
L’idrolisi del GTP funge da orologio
incorporato che spontanemante
riporta allo stato inattivo
adenilato ciclasi inattiva
adenilato ciclasi attiva
La tossina colerica blocca nella forma attiva
La tossina della pertosse inattiva il sistema
- PROTEIN CHINASI Ser/Thr, Tyr
Premio Nobel 1992
Dal genoma si calcola 1.000 differenti protein chinasi
- PROTEIN FOSFATASI
Protein chinasi A
PKA (C2R2 )
fosforila residui di Ser
Glucagone
Adrenalina
Paratormone
ACTH, LH, FSH
C
ATP
2
R
-cAMP
R -cAMP + 2
cAMP
Fosfodiesterasi
AMP
C
+ 4 cAMP
adenilato
ciclasi attiva
membrana
cellulare
R
inibita da
caffeina
teofillina
C
+ ATP
proteina
fosfoproteina
fosfatasi
EFFETTI
FISIOLOGICI
Tossina colerica
A1 + A2
A
B
5 subunita B
B si lega alla membrana della mucosa intestinale
A entra all’interno della cellula e blocca proteine G nella forma attiva
catalizza la ADP ribosilazione delle proteine G
Subunità -Arg-Ribosio -P-P Ribosio - Adenina (ADPribosio)
AMPc 100 volte più elevato
 PKA
apertura canali per il Cl- ed eccessiva perdita di NaCl e H2O
Diarrea con perdita di 1 litro/h acqua ricca di sali
REIDRATAZIONE CON SALI E GLUCOSIO
acetilcolina, vasopressina, ossitocina, neurotrasmettitori
membrana
Fosfatidil inositolo 4,5 bisfosfato (PIP2)
FOSFOLIPASI C
secondi messaggeri sinergici
diacilglicerolo (DAG)
(apolare)
regolatore di PKC- Ca2+
fosforila Ser/Thr
inositolo 1,4,5,trisfosfato (IP3)
(polare idrosolubile)

Rilascio di Ca2+ dal R.E.

Protein chinasi C (PKC)
forma solubile
PKC- Ca2+
trasloca sulla membrana
Recettore dell’insulina
famiglia delle tirosinchinasi
Tetramero 22
alfa extracellulare: sito di legame
dell’insulina
beta intracellulare: attività chinasica
I. Legame dell’insulina attiva
autofosforilazione di residui di Tyr
II. La forma fosforilata ha attività
chinasica verso altre proteine intrac
insulina
P
p
membrana
IRS-1 (substrato 1 del recettore dell’ insulina)
la sua fosforilazione induce
effetti mitogeni,
espressione genica
GLUT-4
biosintesi
proteine
trasporto glucosio
muscolo, tessuto
adiposo
biosintesi
glicogeno
biosintesi
acidi grassi
Insulina
stimola la fosfodiesterasi con calo livelli di AMPciclico
stimola fosfoprotein fosfatasi
IPOGLICEMIA  GLUCAGONE
 Glicogenolisi
attivata fosforilasi, inibita glicogeno sintasi
 Gluconeogenesi
attivata fruttosio 1,6 bisfosfatasi
inibita fosfofruttochinasi
IPERGLICEMIA  INSULINA
 Importo glucosio (GLUT 4)
 Glicogenolisi
inibita fosforilasi, attivata glicogeno sintasi
 Glicolisi
GLUCAGONE, ADRENALINA

adenilato ciclasi

cAMP

protein chinasi A (PKA)
fosforilasi chinasi ()4
subunità catalitica
  siti di fosforilazione
 calmodulina (lega Ca2+)

FOSFORILASI b inattiva
FOSFORILASI a attiva
GLICOGENO
SINTASI-P
(inattiva)
PROTEIN
FOSFATASI -P
(inattiva)
2 ATP
Forma T
poco
attiva
2 ADP
Fosforilasi chinasi
P-P
Fosfoprotein fosfatasi
ATP
G6P
AMP
Forma R
attiva
P-P
Fosforilasi b
controllo allosterico immediato
dipende da carica energetica
Fosforilasi a
controllo covalente ormonale
non soggetto a regolazione
allosterica ATP/AMP
regolazione allosterica scavalcata da quella ormonale se è richiesta risposta
prolungata
Insulina induce defosforilazione
attiva
- PROTEIN FOSFATASI
- GLICOGENO SINTASI forma defosforilata attiva
denominata:
Forma I indipendente da regolazione allosterica
Viceversa
Glicogeno sintasi poco attiva nella forma fosforilata
denominata:
Forma D dipendente da regolazione allosterica
Controllo ormonale: Gluconeogenesi epatica
- Fosfofruttochinasi-2 (PFK-2)
- Fruttosio 2,6bisfosfatasi-2 (FBPasi-2)
Domini diversi dello stesso enzima bifunzionale
enzima defosforilato.  dall’ insulina
ATP + F6P
F2,6 bisP + H2O
fosfoenzima  dal glucagone
Attiva fosfofruttochinasi
Inibisce fruttosio 1,6 bis fosfatasi
in presenza di insulina
F6P + ATP + enzima defosforilato attivo

F2,6 bisP
+ H2O
attiva fosfofruttochinasi
inattiva fruttosio 1,6 bis fosfatasi
AUMENTA GLICOLISI e DIMINUISCE GLUCONEOGENESI
In presenza di glucagone
F6P
+ ATP
 fosfoenzima inattivo + F2,6 bisP + H2O
inattiva fosfofruttochinasi
attiva fruttosio 1,6 bis fosfatasi
DIMINUISCE GLICOLISI e AUMENTA GLUCONEOGENESI
AUMENTA GLICEMIA
Regolazione tramite l’aumento o la diminuizione dell’
espressione di geni che codificano per enzimi chiave.
INSULINA
Aumenta sintesi dell’enzima piruvato chinasi ed aumenta il flusso
glicolitico (per dare precurosi per la sintesi degli acidi grassi).
GLUCOCORTICOIDI
Aumenta sintesi dell’enzima fosfoenolpiruvato carbossichinasi ed
aumenta la gluconeogenesi.