Prof. Riccardo Gavioli
e-mail: [email protected]
tel: 0532-974407
Il virus
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Sottotipi di HIV
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Il virus muta
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Mancanza di modelli animali
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Risposte immuni contro HIV
Anticorpi
•
Linfociti helper
•
Linfociti citotossici
CD4 T cell TCR
MHC-I
•
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CTL
TCR
Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
?
X
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Proteine strutturali
?
?
Proteine regolatorie
Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Vie di somministrazione
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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ADIUVANTE
+ ALUM
+ citochina
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Problemi per lo sviluppo di un vaccino contro HIV/AIDS
•
Diversi sottotipi di virus
•
Il virus muta
•
Mancanza di modelli animali
•
Quali risposte immuni sono protettive?
•
Quale parte del virus usare in un vaccino?
•
Che via di somministrazione usare?
•
Che adiuvante usare?
•
Pochi investimenti dell’industria farmaceutica
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Vaccino italiano: perchè Tat?
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• E’ indispensabile al virus per duplicarsi
• Muta poco ed è conservata tra i diversi sottotipi
• I soggetti con risposte anti-Tat sviluppano la malattia
più tardi
Studi preclinici nel topo
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• La vaccinazione con Tat è sicura
• La vaccinazione con Tat induce risposte immuni anticorpali
MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE
• La vaccinazione con Tat induce risposte immuni cellulari
MEPVDPRLEPWKHPGSQPKT ACTNCYCKKCCFHCQVCFIT KALGIS YG RK KRRQRRR PPQGSQTHQVSLSKQ PTSQSRGDPTGPKE
GSQTHQVSLSKQPTS
VCFITKALGISYGRK
MHC-I
TAT 34-45
CD4 T cell TCR
CTL
TCR
TAT 39-50
Conclusione degli studi preclinici
La scimmia trattata con Tat e messa
a contatto con il virus, non sviluppa
l’infezione!
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Sviluppo del vaccino basato sulla proteina Tat
• Presentazione del dossier per la sperimentazione sull’uomo
• Fase I: sicurezza
• Fase II: sicurezza e immunogenicità
• Fase III: sicurezza, immunogenicità e efficacia
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FASE I SULL’UOMO
VACCINO PREVENTIVO
Protocol Number: ISS-P001
VACCINO TERAPEUTICO
Protocol Number : ISS-T001
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FASE II
VACCINO TERAPEUTICO
ATTUALMENTE IN CORSO IN ITALIA
VACCINO PREVENTIVO
PARTIRA’ IN AFRICA
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Vaccini di seconda generazione: vaccini combinati
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•
I vaccini basati su componenti strutturali del virus (Env, Gag)
hanno fallito
•
I vaccini basati su componenti regolatorie (Tat, Nef, Rev) sono
sicuri ed immunogenici negli animali e nell’uomo
•
Vaccini combinati???
+
FP6-EU Commission in Poverty Diseases
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AVIP Consortium
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P name
Institution
P short name
Country
Ensoli
Istituto Superiore di Sanità Roma
ISS
Italy
Wahren
Karolinska Insitute
KI
Sweden
Le Grand
Commissariàt à l’Energie Atomique
CEA
France
Gavioli
University of Ferrara
UNIFE
Italy
Guzman
German Center for Biotechnology
GBF
Germany
Magnani
University of Urbino
UNIURB
Italy
Krohn
FIT Biotech
FIT
Finland
Erfle
Centre for Enviromental and Health Res.
GSF
Germany
Rappuoli/Barnett
Chiron/Novartis
CHIRON
Italy
Gotch
Imperial College London
ICSTM
United Kingdom
Vardas
University of Witwatersrand
WHC
South Africa
Glashoff
University of Stellembosch
US
South Africa
Clerici
University of Milan
UNIMI
Italy
Poli
San Raffaele
DIBIT
Italy
Holmes
National Institute fro Biological Standards
NIBSC
United Kingdom
Caputo
University of Padua
UNIPD
Italy
Studi preclinici nel topo
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Risposte immuni dopo
vaccinazione con un singolo
componente:
Risposte immuni di vaccini
combinati contenenti Tat:
Env
Env + Tat
+
Risposte immuni contro Env
Immunization
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Positive
responses
PBS
0
Env
7
Env + Tat
12
Gavioli et al., Vaccine, 2006
Cellini et al. Virol J., 2008
Patent: Vaccines N. PCT/EP2004/011950)
Risposta immune ad un antigene
1. anticorpale
2. cellulare
MHC di classe I
MHC di classe II
MHC di classe I
MHC di classe II
Peptide binding motif
Associazione del peptide alle molecole di
MHC-I
Posizione 2
C-terminale
a2
a3
a1
b2 m
Proteasoma e generazione dei
peptidi che legano le molecole
di MHC-I
Antigen processing
Epitopo
immunogenico
Proteina
virale
ubiquitinazione
Degradazione
nel
proteasoma
Nucleo
PROPRIETÀ SPECIFICHE DEL
PROTEASOMA
Distr ibuzione ubiquitaria
Lo cali zzaz ione citoplasmatica e nucleare
Dim ensi on i enormi (2.5 MDa)
Str utt ura cilindrica cava
ATP -dipe nde nte
Pr oteas i un ica , non un insieme di proteasi
Riconosci ment o dei substrati marcati con
ubiquitina
6 s iti att ivi con tre differenti attività, confinati
in compartimenti isolati
Meccan ism o cat alit ico basato sulla treonina
N-terminale
+
base
coperchio
+
Core 20S
Complesso 19S
Proteasoma 26S
Rappresentazione schematica del proteasoma 26S (core 20S + regolatore 19S)
REQUISITI PER LA DEGRADAZIONE DELLE
PROTEINE
Pr esen za
di segnali di degradazione
Ubiq uitina zi one
delle proteine da parte di E1, E2, E3
Ri conosc ime nto
delle proteine ubiquitinate da parte del
proteasoma
Ubiquitina
e
marcatura delle proteine
Ubiquitina:
•
•
•
•
Piccola proteina globulare di 8 KDa
Costituita da 76aa
Ubiquitaria e altamente conservata
Struttura tridimensionale rigida e compatta
Vie di sintesi dei monomeri di ubiquitina
Proteina
ubiquitinata
Catena di poli-ubiquitina neosintetizzata
Ub
Ub
Ub
Ub
Ub
UBP
Ub
proteina
UCH
Ub
Ub
Ub
Ub
Subunità ribosomiali
Ub proteine ribosomiali
UCH
Ub
Catena di
poli-ubiquitina
in fase di
disassemblaggio
UBP
SH
E1
+ Ub
O
C
ATP
OH
E1
SH
O
C
E2
SH
O
E2 SH C Ub
Ub
AMP+PPi
SH
S
E1
E2
(Ub)n
Ub
Ub
ATP
S
peptidi
peptidi
aminoacidi
E3
SH
AMP+PPi
proteasoma
NH
Ub
NH3-
K6
K29
G
G
K6
K48
K29
G
G
G
K6
K
proteina
K48
K63
G
K29
K48
G
K
proteina
K
proteina
K6 o K9
K29
K48
?
proteolisi
proteolisi
Funzioni dell’ubiquitina
G
K63
G
G
K63
G
G
proteina
K
K63
riparazione DNA
regolazione ribosomale
attiviazione chinasi
endocitosi di recettori di
membrana
G
K
proteina
proteina
mono
ubiquitinazione
funzioni non proteolitiche
Struttura del core 20S
a7
a1
b1
b7
a7
a6
a5
a2
a3
b2
b3
b6
a6
b5
a5
a4
b4
b4
a4
Ingresso alla camera proteolitica
a4
a4
a6
a5
a7
a3
a1
a2
Ingresso chiuso
a6
a5
a7
a3
a1
a2
Ingresso aperto
Camere interne al proteasoma
anticamera
camera
proteolitica
centrale
anticamera
REGOLAZIONE DELLE ATTIVITA’ PROTEOLITICHE
I regolatori del
proteasoma
Core 20S + regolatore 19S = proteasoma 26S
+
base
coperchio
+
Core 20S
Complesso 19S
Proteasoma 26S
Regolatore 19S
• Formato da: una base 2 subunità di grandi dimensioni
+ 6 subunità ATPasiche
un coperchio 8 subunità
• Funzioni:
–
–
–
–
–
Riconoscimento delle proteine target marcate con ubiquitina
Attività deubiquitinante
Controllo dello stato di apertura del canale del proteasoma
Accessibilità alla camera proteolitica
Determina l’unfolfing delle proteine da degradare
Regolatore PA28 associato al proteasoma
+
+
PA28
Core 20S
Proteasoma 26S
PA28
Il regolatore PA28
• Complesso eterodimerico: 6 subunità, 3 a e 3
b
• Funzioni:
– aumenta l’efficienza di degradazione del
proteasoma
– Favorisce la fuoriuscita dei prodotti (peptidi)
• La sua espressione è regolata dall’IFN-
Immunoproteasoma
I peptidi antigenici derivano
dalla degradazione di:
• Proteine citosoliche, nucleari e di
membrana
• Proteine non conformate
• DRIPs
proteina
epitopo
NH2-
-COOH
Epitopo corretto
NH2-
-COOH
-COOH
NH2-
Estensioni all’N-terminale
-COOH
NH2NH2-
Taglio dell’epitopo
NH2-
-COOH
-COOH
NH2-
-COOH
-COOH
NH2-
Estensioni al C-terminale
-COOH
NH2NH2-
Estensioni all’N- e C-terminale NH 2
-COOH
-COOH
Antigen processing
Epitopo
immunogenico
Proteina
virale
ubiquitinazione
Degradazione
nel
proteasoma
Nucleo
Aminopeptidasi
Citoplasmatiche
LE AMINOPEPTIDASI
Ruolo
Svolgono un ruolo fondamentale nella formazione
dell’epitopo immunogenico: infatti il proteasoma
è in grado di generare solo l’estremità Cterminale mentre per l’N- terminale intervengono
le aminopeptidasi.
Si distinguono in:
• Citoplasmatiche
• Endoplasmatiche
Ruolo delle peptidasi
citosoliche nella
presentazione
antigenica
Classificazione delle peptidasi citosoliche
COMPLETANO L’ATTIVITA’
DEL PROTEASOMA
DISTRUGGONO I PEPTIDI
GENERATI DAL PROTEASOMA
TPPII (TRIPEPTIDYL PEPTIDASE II)
BH (BLEOMYCIN-HYDROLASE)
PSA (PUROMYCIN SENSITIVE
AMINOPEPTIDASE)
LAP (LEUCYN-AMINOPEPTIDASE)
TOP (THIMET OLIGOPEPTIDASE)
Epitopo
immunogenico
Proteina
virale
ubiquitinazione
Degradazione
nel
proteasoma
Nucleo
Aminopeptidasi
Citoplasmatiche
e del Reticolo
Endoplasmatico
Ap. Golgi
TAP1
Trasferimento
nel Reticolo
Endoplasmatico
MHC I
vuoto
Formazione
del complesso
MHC-I/peptide
TAP2
Espressione del
complesso MHC-I/peptide
Parte II
Una proteina come immunomodulatore
Immunomodulatory effects of Tat protein
• Tat promotes MDCC maturation and
activation
• Tat induces immunoproteasomes in
MDCC
MFI
Medium Buffer
• Tat modifies expression and activity
of immunoproteasomes in T and B
cells
• Tat favors the presentation of
subdominat T cell responses in viral
infected cells
HLA-DR
CD40
CD83
CD86
313
34
6
37
303
36
5
40
Tat (% increase
Native or
vs control)
Oxidized
46.9
Native
10.6
Oxidized
38.9
Native
8.3
Oxidized
480.0
Native
40.0
Oxidized
97.5
Native
15.0
Oxidized
• Tat increases memory T cell
reactivation
Fanales-Belasio et al., J.Immunol. 2002
Immunomodulatory effects of Tat protein
• Tat promotes MDCC maturation and
activation
• Tat induces immunoproteasomes in
MDCC
• Tat modifies expression and activity
of immunoproteasomes in T and B
cells
• Tat favors the presentation of
subdominat T cell responses in viral
infected cells
a Subunits
LMP7
LMP2
MECL1
0 24h 48h 72h
0.5 g/ml Tat
0
0,1 1 10
g/ml Tat
• Tat increases memory T cell
reactivation
Gallerani et al., unpublished
Immunomodulatory effects of Tat protein
• Tat promotes MDCC maturation and
activation
• Tat induces immunoproteasomes in
MDCC
B Cells
T Cells
a2
PA28a
• Tat modifies expression and activity
of immunoproteasomes in T and B
cells
• Tat favors the presentation of
subdominat T cell responses in viral
infected cells
LMP2
LMP7
MECL1
0
Tat
0
Tat
• Tat increases memory T cell
reactivation
Gavioli et al., J.Immunol. 2004
Remoli et al., Biochemical J. 2006
Immunomodulatory effects of Tat protein
Chimotrypsin-like activity
• Tat promotes MDCC maturation and
activation
• Tat induces immunoproteasomes in
MDCC
• Tat favors the presentation of
subdominat T cell responses in viral
infected cells
• Tat increases memory T cell
reactivation
3000
2000
2000
1000
1000
0
0
Trypsin-like activity
Fluorescence units
• Tat modifies expression and activity
of immunoproteasomes in T and B
cells
3000
3000
3000
2000
2000
1000
1000
0
0
Post-acidic activity
1000
1000
500
500
0
0
Min
Min-Tat
Mon Mon-Tat
Gavioli et al., J.Immunol. 2004
Immunomodulatory effects of Tat protein
• Tat promotes MDCC maturation and
activation
• Tat induces immunoproteasomes in
MDCC
% specific lysis
YLQ-specific CTL
• Tat modifies expression and activity
of immunoproteasomes in T and B
cells
• Tat increases memory T cell
reactivation
80
40
40
0
0
15:1
5:1
CLG-specific CTL
% specific lysis
• Tat favors the presentation of
subdominat T cell responses in viral
infected cells
80
80
80
40
40
0
0
Min Min-Tat
Mon Mon-Tat
Gavioli et al., J.Immunol. 2004
Patent: Vaccines N. PCT/EP2004/011950)
Immunomodulatory effects of Tat protein
Tat promotes MDCC maturation and
activation
Tat modifies expression and activity of
immunoproteasomes in T and B cells
Tat favors the presentation of
subdominat T cell responses in viral
infected cells
Tat increases memory T cell
reactivation
80
% Specific lysis
Tat induces immunoproteasomes in
MDCC
70
60
50
40
30
20
10
0
Peptide CLG
Tat 0,5 g/ml -
CLG
+
YLQ
-
YLQ
+
IVT
-
IVT
+
Cellini et al., unpublished
Vaccine studies
Immune responses in mice
vaccinated with single antigens:
Immune responses in mice
vaccinated with single antigens in
combination with Tat:
Gag
Gag + Tat
Env
Env + Tat
Env V2-deleted
Env V2-deleted + Tat
Effect of Tat on epitope-specific T cell responses against
the HIV-1Gag antigen
Immunization protocol
Gag/Tat
Group
Treatment
#1
PBS/Freund
#2
Gag/Freund
#3
Gag + Tat/Freund
Schedule of
immunization
Route
100 µL subcute
0
14
28
1st
2nd
3rd
Gag protein: HIVSF2
Gag peptides (15mers overlapping by 10 aa, of clade B HIV-1)
Tat: HIVIII B (Hxbc2, Clone BH10)
38
sacrifice
Gag peptides inducing IFN- responses
Immunization
Positive
responses
PBS
0
Gag
7
Gag + Tat
12
Effect of Tat on epitope-specific T cell responses
against the HIV-1Env antigen
Immunization protocol
Env/Tat
Group
Treatment
#1
PBS/Alum
#2
Env/Alum
#3
Env + Tat/Alum
Schedule of
immunization
Route
100 µL subcute
0
14
28
1st
2nd
3rd
Env protein: SF1623-gp160
Env peptides (15mers overlapping by 10 aa, of SHIV-1)
Tat: HIVIII B (Hxbc2, Clone BH10)
38
sacrifice
Env peptides inducing IFN- responses
Immunization
Positive
responses
PBS
0
Env
5
Env + Tat
17
Env peptides inducing IL4 responses
Immunization
Positive
responses
PBS
0
Env
4
Env + Tat
4
Tat ha un effetto su altre infezioni virali?
Effects of Tat on HSV1 infection
0
Intravaginal (IV) inoculation of
HSV-1 LVLacZ (control)
or
HSV-1 LVTat
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28
Intravaginal (IV)
challenge with
HSV-1 wt
Cellular response
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IFN-γ Assay
SSI Epitope
ITA Epitope
900
QTF Epitope
600
150
SFU/million cells
SFU/million cells
100
SFU/million cells
600
300
300
50
0
0
HSV1-LVLacZ
HSV1
HSV1-LVTat
HSV1-Tat
0
HSV1-LVLacZ
HSV1
HSV1-LVTat
HSV1-Tat
HSV1
HSV1-LVLacZ
HSV1-Tat
HSV1-LVTat
The presence of Tat increases the cellular response against the HSV-1 immunodominant and
subdominant epitopes.
Humoral response
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3500
3000
Titolo IgG
2500
2000
1500
1000
500
0
Topo 1
Topo 2
Topo 3
HSV1 LVTat
Topo 4
Topo SX 5
Topo 1
Topo 2
HSV1 LVLacZ
Topo 3
MICE DISEASE PROGRESSION AFTER CHALLENGE (letal doses) WITH
HSV-1wt
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103 IV HSV-1LVLacZ
4
Disease Severity
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Time post challenge (Days)
14
15
16
17
18
19
20
103 HSV1 LVTat
4
Disease Severity
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Time post challenge (Days)
13
14
15
16
17
18
19
20
