spettrofotometria

SICSI VIII Ciclo A.A. 2008/2009
SPETTROFOTOMETRIA
Corso di Laboratorio di Chimica Analitica
Prof. S. Andini
Spettrofotometria
Il termine spettrofotometria designa lo studio dell’assorbimento
di radiazioni elettromagnetiche da parte della materia. Si tratta
di un termine più specifico del termine generale spettroscopia
elettromagnetica, in quanto la spettrofotometria si occupa di
radiazioni che vanno dal vicino ultravioletto al vicino infrarosso e
di luce visibile.
Destinatari
Alunni iscritti al III anno di un Istituto
Tecnico ad Indirizzo Chimico
Prerequisiti
Natura di una radiazione
elettromagnetica
Prerequisiti
ENERGIA DI UNA RADIAZIONE
ELETTROMAGNETICA
Una radiazione elettromagnetica consiste in “pacchetti discreti” di energia chiamati
FOTONI, la cui energia dipende dalla frequenza, secondo l’equazione:
E=h*v
l=c/v
h indica la costante di Planck: h=6,63x10-34 J .s
C= velocità della luce, uguale a 2,998x10-10 cm . sec-1
I Diversi tipi di radiazioni elettromagnetiche
Obiettivi
Raggiungimeto di un buon livello di conoscenza della
spettroscopia UV-Visibile
Comprensione dell’importanza della spettrofotometria
come tecnica analitica di determinazione quali-quantitaviva
delle diverse sostenze
Applicazione pratica della legge di Lambert-Beer
Lo Spettro Elettromagnetico
Lo spettro elettromagnetico è costituito dall’ordinata sequenza delle
radiazioni secondo la loro lunghezza e frequenza d’onda
Spettri e Colori
I metodi di analisi spettrochimici sono basati sull’analisi dello spettro
elettromagnetico ottenuto da sostanze, esso può essere di emissione o di
assorbimento
Una sostanza investita da luce bianca ci appare colorata perché assorbe
alcune radiazioni e ne trasmette delle altre, le quali appariranno con un
colore che è la risultane delle radiazioni non assorbite
LUCE MONOCROMATICA E
POLICROMATICA
La luce bianca è in realtà un miscuglio di radiazioni di diversa frequenza e lunghezza
d’onda, si parla in questo caso di un fascio di luce policromatica
Si parla di un fascio di luce monocromatica quando esso è costituito da radiazioni di
una sola frequenza e lunghezza d’onda
Spettrofotometro
Cuvette
(Provetta che contiene
il campione)
Luce
entrante
Soluzione
Luce
uscente
Sorgente
(Emette radiazioni
elettromagnetiche)
T= I/I0
A= -logT
Caratteristiche dell’ assorbimento
 Assorbimento: processo in cui i fotoni interagendo
con atomi e molecole determinano transizioni da uno
stato “fondamentale” di energia ad uno “eccitato”
M + h → M*
 Distinguiamo due tipi di assorbimento:
– Atomico
– Molecolare
Transizioni elettroniche e fotoni
L’energia di un fotone assorbita da un atomo può
determinare il passaggio di elettroni verso livelli
energetici superiori
Assorbimento Molecolare
 Più complesso dell’assorbimento atomico perchè
in una molecola bisogna considerare:
– Transizioni elettroniche
– Transizioni vibrazionali
– Transizioni rotazionali
Ad ogni livello elettronico
possono essere associati più
livelli vibrazionali e ad ognuno
di questi più livelli rotazionali.
SCHEMA DEI LIVELLI ELETTRONICI, VIBRAZIONALI E
ROTAZIONALI DI UNA MOLECOLA
E2
E1
UV-VIS
E
v2
v1
IR
r2
r1
r0
v0
E0
Spettro di assorbimento molecolare del
Benzene in fase gas
Transizioni elettroniche
Transizioni vibrazionali
Bande di
assorbimento
Legge di Lambert-Beer
l
l
A= ε x l x C
C
Tipi di Spettrofotometro
Spettrofotometro monoraggio
Spettrofotometro a doppio raggio
Sorgenti
Per la regione del visibile si utilizzano lampade ad
incandescenza (a filamento di Tungsteno, lampade
quarzo-iodio o lampade tungsteno-alogeno)
Per la regione UV si usano lampade a scarica in un gas
(deuterio o a idrogeno)
Gli spettrofotometri UV-vis avranno quindi al loro interno
due diverse lampade che vengono intercambiate dal
meccanismo interno
Per la regione IR si usano barrette di vari materiali,
sempre riscaldate elettricamente a temperatura
DIVERSI TIPI DI CUVETTE
VETRO O PLASTICA (VISIBILE)
QUARZO (ULTRAVIOLETTO)
RIVELATORE, RIELABORAZIONE E
PRESENTAZIONE DEI DATI
 Il rivelatore è un dispositivo capace di produrre un
segnale elettrico che dipende dall'energia delle
radiazioni ricevuta.
 Il segnale elettrico (proporzionale all'intensità luminosa)
viene opportunamente amplificato ed un amperometro
ne rileva l’intensità.
 Tramite un convertitore digitale è possibile ottenere i
risultati dell’analisi direttamente su un personal
computer che ne elabora i dati.
Proprietà di assorbimento delle bio-molecole
Molecole con assorbimento nell’UV
•Acidi nucleici (DNA, RNA)
• Aminoacidi
• Proteine
Acidi nucleici (DNA, RNA):
Assorbimento massimo compreso tra 250 e 270 nm
Proteine:
I residui amminoacidici Tirosina e Triptofano,
contenuti in una proteina, presentano un massimo di
assorbimento a 280 nm
Assorbanza
Spettro di assorbimento delle basi del DNA
Lunghezza d’onda (nanometri)
Assorbanza
Spettro di assorbimento di alcuni amminoacidi
Lunghezza d’onda (nanometri)
Spettro di assorbimento del DNA e delle proteine
Proteina
Assorbanza
Assorbanza
DNA
Lunghezza d’onda (nanometri)
Lunghezza d’onda (nanometri)
Biomolecole con assorbimento nel visibile
Spettro di assorbimento dell’emoglobina
Lunghezza d’onda (nanometri)
Determinazione della Concentrazione della
Sostanza in Esame
METODO DIRETTO
A= ε x l x C
C= A/ (ε x l)
l
ε = A0/(l x C0)
METODO DELLA RETTA DI LAVORO
Limiti della legge di Lambert e Beer
A<1