Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces arboricolus CBS 10644
Essudati di quercia
Saccharomyces cariocanus Y-27337
Associato a Drosophila e pulqué (bevanda alcolica)
Saccharomyces paradoxus Y-17217
Ambienti naturali
61
94
Origine
Dominio
Eukaryota
Regno
Fungi
Phylum
Ascomycota
Sottodivisione
Saccharomycotina
Classe
Hemiascomycetes
Ordine
Saccharomycetales
Famiglia
Saccharomycetaceae
Raramente isolato in ambienti naturali
Saccharomyces cerevisiae Y-12632
59
70
Suolo e foglie in decomposizione
Saccharomyces mikatae Y-27341
Giappone
Saccharomyces kudriavzevii Y-27339
100
Fermentazioni spontanee
Saccharomyces bayanus var. bayanus Y-12624
72
Genere
Saccharomyces
Saccharomyces pastorianus Y-27171
Non presente in ambienti naturali
98
Fermentazioni spontanee
Saccharomyces bayanus var. uvarum Y-17034
Kazachstania viticola Y-27206
Zygosaccharomyces rouxii Y-229
Cellula di lievito
• Le cellule di S. cerevisiae sono
generalmente ellipsoidali
• Da 5 a 10 mm di diametro più largo e da 1
a 7 mm quello più piccolo
• Volume cellulare da 29 or 55 mm 3 per
una cellula aploide ed una diploide
rispettivamente. Le dimensioni delle
cellule aumentano con l’età.
Diensione e forma
Volume (mm3)
Diameter (mm)
Haploid cellDiploid cell
70
120
4
5-6
Citoplasma ed organuli
citoplasmatici
Citoplasma
Gemma
Membrana cellulare
Vacuolo
Perossisoma
Mitocondrio
Nucleo
Reticolo
endoplasmatico
Golgi
Spazio periplasmatico
Parete cellulare
• Citoplasma
circondato da
membrana e parete
cellulare
• Mitocondri, inclusioni
citoplasmatiche a
forma di goccioline
contenenti lipidi e
glicogeno
• Vacuoli citoplasmatici
La parete cellulare ( rappresenta il 1530% del peso secco della cellula)
• Composizione costante nei diversi taxa
• E’ una struttura dinamica che si adatta ai
cambiamenti fisiologici e morfologici
(coniugazione, sporulazione, sviluppo
pseudoifale).
• Ha 4 funzioni importanti: i) mantenimento della
omeostasi; ii) protezione contro gli stress fisici;
iii) mantenimento della forma; iv) impalcatura
per le proteine
• E’ costituita principalmente da
polisaccaridi 80-90%
• polimeri del mannosio (mannoproteine,
circa il 40% del peso secco della parete),
• polimeri del glucosio (b-glucano, circa il
60% del peso secco della parete)
• polimeri di N-acetilglucosamina (chitina,
circa il 2% del peso secco della parete).
• Il b-glucano può formare lunghe catene
(85%) di unità di b-1,3 glucano e catene
più corte (15%) di b-1,6 glucosio.
MC
SP
P
Mannoproteine
• Le mannoproteine costituiscono il 30-40%
della parete con un peso molecolare
medio (kDa) di 100-200.
• Sono costituite da mannosio ( circa il 90%)
e, a seconda del ceppo e della fase di
sviluppo, da N-acetilglucosamina e
mannosilfosfato.
• Queste glicoproteine hanno un’importante
funzione protettiva
• Permettono alla cellula di crescere sotto
forma pseudoifale e invasiva,
• di flocculare,
• di formare biofilm; Tra queste proteine, le
adesine sono tra le più studiate;.
• La chitina, un polimero lineare di N-acetilglucosamina, è poco rappresentata nella
parete dei lieviti (1-2%) e si trova
soprattutto nell’anello cicatriziale di
distacco della gemma.
• Presenza di molti enzimi, tra i più
caratteristici l’invertasi che catalizza
l’idrolisi del saccarosio in glucosio e
fruttosio.
• La parete contiene anche endo ed esoglucanasi che servono per costruire la parete
• Questi enzimi endogeni sono coinvolti
nell’autolisi della parete cellulare.
Funzione
Funzione principale è proteggere la cellula e
inoltre:
a) E’sede per gli enzimi periplasmatici, (fosfatasi
acida, proteasi, diverse idrolasi)
b) Polimeri solubili negli strati esterni servono in
forma idratata come gel di protezione contro
l’essiccamento
c) Adesione
Le cellule di lievito si possono trattare con enzimi litici
( ad esempio l’elicasi, dai succhi digestivi della lumaca)
in presenza di stabilizzatori osmotici.
La parete cellulare è rimossa e si formano gli sferoblasti.
Questo è importante per il miglioramento genetico e
formazione del protoplasto
La membrana citoplasmatica
• E’ costituita principalmente di lipidi e proteine.
• I principali fosfolipidi sono, la fosfoetanolamina,il
fosfatidilinositolo,e fosfatidilcolina.
• Lo spessore della membrana è di 7.5 nm
• Tra gli steroli : ergosterolo,deidroergosterolo e
zimosterolo. Sono prodotti esclusivamente nei
mitocondri durante la fase lag.
• Le proteine di membrana includono:gli enzimi per la
sintesi della parete, per la trasmissione dei segnali,
per il trasporto dei soluti (permeasi, canali, ATPasi),
ecc
Funzione della membrana
plasmatica
• Fornisce permeabilità selettiva,
controlla ciò che entra e ciò che esce.
• Regola la nutrizione del lievito,
assorbendo i carboidrati, i composti
del carbonio o ioni, espellendo le
molecole tossiche
• Risposta agli stress e sporulazione
Citoplasma
• Ha un pH acido circa 5.25
• Contiene enzimi solubili e ribosomi liberi
• Sono presenti gli enzimi per la glicolisi e la
fermentazione alcolica e la trealasi
• E’ presente anche trealosio un
disaccaride di riserva
• Il citoplasma è ricco di ribosomi, vi è il
reticolo endoplasmatico ed il Golgi.
• I vacuoli, da 1 a più a seconda dello stadio di
sviluppo di dimensione da 0-3 a 3 mm.
• Tra i ruoli principali di questi organelli vi sono il
pH e l’osmoregolazione, la degradazione delle
proteine (autofagia), stoccaggio degli aminoacidi
(un quarto del pool amminoacidico della cellula),
piccoli ioni e polifosfati. L’energia necessaria
per stoccare questi composti contro il gradiente
di concentrazione avviene tramite una specifica
ATPasi.
Il glicogeno
• Il glicogeno è la principale riserva
glucidica e si accumula nella fase
stazionaria in granuli di 40 nm di
diametro.
• l glicogeno è formato dall’aggiunta
sequenziale di unità di glucosio da UDPglucosio, per mezzo della glicogeno
sintetasi
• Il trealosio è sintetizzato per mezzo della
trealosio sintetasi da glucosio-6-fosfato e
UDP-glucosio.
I mitocondri: struttura asimile a
quella degli altri eucarioti
☛ Una membra esterna, contenente gli enzimi
per la sintesi di lipidi
☛ Lo spazio tra le membrane
☛ Una membrana interna contenente NADH e
succinato deidrogenasi, i componenti della
catena respiratoria e la ATPasi,e varie proteine
di trasporto.
☛ La matrice mitocondriale, contenente gli enzimi
per la ossidazione degli acidi grassi, del ciclo
dell’acido citrico,il DNA mitocondriale, con gli
elementi per la trascrizione mitocondriale e la
sintesi proteica (ribosomi 60 S e tRNAs)
I mitocondri: sono strutture dinamiche la
cui forma, grandezza e numero varia a
seconda di diversi fattori:
Specificità di ceppo
Fase del ciclo cellulare
Condizioni di crescita
Pressione parziale di ossigeno
Concentrazione di glucosio
Presenza di substrati non fermentabili
Disponibilità di sterolo e di acidi grassi e di
particolari ioni metallici (Mg++)
I mitocondri
• Per i lieviti sono veri organi respiratori. In
aerobiosi S.cerevisiae ne contiene circa 50.
In anaerobiosi degenerano a un promitocondrio e non sono indispensabili,
almeno per la funzione respiratoria.
• Esistono dei mutanti, r‚ “petite” , con ampie
delezioni del genoma mt e r°mancanti del tutto
del genoma
• L’aggiunta di ergosterolo e acidi grassi
insaturi riducono questa degenerazione
Queste mutanti sono incapaci di sviluppare in
mezzi che contengono solo fonti di carbonio
non-fermentabili, come glicerolo ed etanolo, e
formano piccole colonie quando crescono in
anaerobiosi in terreni contenenti una fonte di
carbonio fermentabile come il glucosio
• I mitocondri possiedono una molecola di DNA
(mtDNA) di 75-150 kb, che contiene geni
codificanti per la sintesi di enzimi respiratori e
dei ribosomi.
Altre funzioni della matrice
mitocondriale
- sintesi e desaturazione di acidi grassi e
lipidi,
- biosintesi di ergosterolo,
- risposta ed adattamento agli stress,
- enzimi per la sintesi di particolari
aminoacidi ed acidi dicarbossilici, basi
puriniche e pirimidiniche, porfirine
- mobilizzazione del glicogeno
I perossisomi
• I perossisomi dei lieviti contengono molte ossidasi
che servono nella utilizzazione ossidativa di
specifiche fonte di azoto e di carbonio.
• Gli organelli si sviluppano da piccoli perossisomi
presenti in cellule che crescono in presenza di
glucosio
• Tale sintesi è associata alla presenza di enzimi
perossisomici, come la catalasi e l’alcol ossidasi
• Poichè I mitocondri mancano della attività di ßossidazione, I perossisomi sono I siti di
degradazione degli acidi grassi
Assetto genetico dei lieviti
• S.cerevisiae ha un genoma
relativamente piccolo, 3 x quello di
E.coli e 260 < di quello umano
• I ceppi aploidi contengono ~ 12-13 kb di
DNA nucleare con 16 cromosomi
lineari, ciascuno con un singolo
filamento DNA di 200-2200 (kb) kilobasi
• Il genoma di S.cerevisiae contiene ~
6300 geni di cui 5885 codificanti
proteine
Elementi extracromosomici
• Sono presenti diversi elementi genetici
non-Mendeliani nel nucleo (per es.
transposoni e il plasmide a DNA 2mm),
nei mitocondri ed nel citoplasma (come
particelle simili a virus ed elementi simili
ai prioni)
• Contiene circa 35-55 copie di
retrotransposoni (Elementi Ty).
• Ogni cellula contiene 50-100 copie
plasmide a DNA 2mm di cui non si
conosce la funzione
• 2 mm ha una dimensione di 6,3 kb ed è
ereditato in maniera non-mendeliana. Il
plasmide codifica 4 geni, ha una origine di
replicazione e due sequenze di 599 bp
ripetute e invertite. E’ il vettore più
utilizzato in ingegneria genetica
• . Altri elementi genetici extra-cromosomali
che possono essere presenti nel
citoplasma sono i prioni denominati PSI
(ψ), ETA (η) e URE3, che segregano in
maniera non mendeliana.
• I prioni PSI (ψ) e ETA (η) aumentano il
numero di mutazioni per scivolamento
(frameshift) e la soppressione del codone
UAA (non codificante per nessun
amminoacido) conferendo alla colonia un
colore ocra.
I lieviti killer: Nel citoplasma del lievito è
possibile riscontrare la presenza di
molecole di RNA virale a doppio
filamento che conferiscono il fenotipo
killer
• Nel 1963 Bevan e Makower hanno
scoperto il fenomeno killer in
Saccharomyces cerevisiae
• Fenotipo killer: secrezione di una proteina
o tossina glicoproteica (tossina killer) che
uccide cellule sensibili dello stesso genere
o generi affini senza un diretto contatto
cellula-cellula.
• Il carattere killer è stato identificato in
numerosi ceppi tra i diversi generi di
lieviti,quali Saccharomyces, Pichia,
Kluyveromyces, Candida, Kloeckera,
Hanseniaspora, Rhodotorula,
Trichosporon, Debaryomyces,
Cryptococcus.
• La presenza della tossina killer non è
condizione sufficiente a favorire lo
sviluppo preferenziale del lievito
• I ceppi killer sono immuni alla propria tossina,
ma sono sensibili alla tossina secreta da altri
ceppi killer (vedi figura sottostante)
Classificazione delle tossine killer
• Le tossine in S.cerevisiae sono state classificate in tre
gruppi (K1, K2,eK28)
• Ciascuna di queste secerne una tossina killer, unica e
specifica che rende immuni le cellule che la producono.
• La presenza di queste tossine è associata alla presenza
di un virus satellite M-dsRNA ( ScV-M1,ScV-M2 oScVM28 per Saccharomyces)
• Questo virus dipende dalla presenza di un altro virus L-A
(helper virus) che è stabilmente mantenuto e replicato
nella cellula di lievito.
• ScV-L-A e ScV-M sono incapsulati separatamente in
capsidi codificati da ScV-L-A dsRNA e sono presenti in
un alto numero di copie nel citoplasma della cellula di
lievito
• Le cellule che non contengono dsRNA oppure
solo L-A sono “sensibili non killer”
• Mentre quelle che contengono ScV-M1,ScV-M2
oScV-M28 sono killer immuni
• I virus killer si autoselezionano uccidendo i
segreganti senza killer.
• I ceppi sensibili sopravvivono accoppiandosi con
i killer, con una eredità di tipo non Mendeliana
• I virus che codificano tossine killer sono
incompatibili a livello replicativo, cioè si
escludono l’uno con l’altro nelle infezioni miste
e sono instabili.
• L-A è un micovirus che si replica
autonomamente
• Appartiene alla famiglia dei Totiviridae ed
ha un genoma incapsulato in un capside
icosaedrico.
• Il genoma è costituito da un singolo
segmento di dsRNA che codifica per una
proteina capsidica Gag ed una Gag-pol,
una RNA – polimerasi-RNA dipendente.
• Una sua importante funzione è mantenere
il virus M, e per questo è detto virus
helper.
Genoma di M
• Il genoma di M-dsRNA codifica per una
preprotossina (pptox)
• Dipende per la replicazione e per la
formazione del capsomero da L-A virus
• Il genoma di cerca 1.9 Kb, di cui 1 Kb per
la sintesi della protossina e 0.6 per i
processi di mantenimento.
• Risulta diviso in due regioni M1-1 e M1-2
La tossina Killer
• Le tossine sono proteine o glicoproteine
• Molte sono instabili ad alte temperature ed alti
pH
• La tossina viene sintetizzata come preprotossina
composta da diverse sub -unità
• La preprotossina, sintetizzata e glicosilata nel
reticolo endoplasmatico, è trasportata
nell’apparato di Golgi e trasformata in tossina
matura.
Nutrizione
1. I lieviti sono in contatto diretto con
l’ambiente e si nutrono:
a) Assorbimento diretto di piccole molecole
b) Degradazione o digestione di molecole
polimeriche, amido proteine, cellulosa
Sviluppo e ciclo vitale di
Saccharomyces cerevisiae
• In condizioni ottimali di crescita S.
cerevisiae raddoppia la sua massa ogni 90
minuti.
• Il suo sviluppo avviene per gemmazione
multilaterale, cioè la cellula madre dà
origine a una gemma, la cellula figlia di
dimensioni più piccole che dopo essersi
staccata dalla cellula madre continuerà il
suo accrescimento.
• . La formazione dello pseudomicelio (per
differenziarlo dal micelio vero o ifale dei
funghi filamentosi) avviene quando le
cellule, generalmente più allungate, non si
staccano dalla cellula madre formando
una catena che può essere lineare o
ramificata. Le colonie appaiono così
sfrangiate e in mezzi liquidi formano veli
estesi e spessi.
Preparazione alla
replicazione del DNA
G1
M
Mitosi
S
G2
Preparazione
alla mitosi
Replicazione
del DNA
• I ceppi di S. cerevisiae possono essere
stabilmente aploidi (con 16 cromosomi) o
diploidi (con 16x2 cromosomi): entrambi i
tipi sono in grado di sporificare
(riproduzione sessuale).
• Le cellule aploidi possono essere di due
tipi sessuali (mating types) chiamati MATa
e MATa. Le cellule di MATa producono un
peptide di 13 aminoacidi, il fattore a ,
mentre le cellule di MATa, producono il
fattore sessuale a, peptide di 12
aminoacidi.
Fattore-α
α
a
APLOIDE
Fattore-a
Mating
a/α
DIPLOIDE
Meiosi e formazione di
spore
ASCO
SPORE
Rottura della parete
dell’asco
Germinazione
a
α
a
α
• I ceppi che mantengono il loro stato
aploide sono detti eterotallici. Nel ciclo
omotallico, una singola cellula aploide
(spora) dà origine a una progenie diploide
che è capace di meiosi.
• I ceppi omotallici differiscono dagli
eterotallici per la presenza di un gene per
l’omotallismo (HO), mentre gli eterotallici
hanno la versione non funzionante di
questo gene (ho).
L’autodiploidizzazione
• Nei ceppi HO, il locus MAT cambia da
MATa a MATa a ogni divisione cellulare,
cioè producono cellule con entrambi i
mating types, e sono detti
autodipolidizzanti.
• Perché questo possa avvenire le cellule
devono cambiare l’informazione al locus
MAT
• . Una cellula omotallica a (che ha un locus
MATa) dà origine a una progenie a che ha
un locus a e fenotipo a
• Questo cambiamento nel locus MAT è in
relazione a una programmazione che
prevede l’attivazione di informazioni
genetiche silenti attraverso il loro
spostamento da una parte del genoma ad
un’altra.
Aploide a
HML α
MAT a
HMR a
Cromosoma III
Conversione mating-type
Rimozione e
degradazione della
vecchia cassetta
HML α
HMR a
Cromosoma III
Sintesi
Aploide α
HML α
MAT α
HMR a
Cromosoma III
Gene silente α
Gene silente a
