BIOLOGIA MOLECOLARE PER CORSO DI LAUREA IN MEDICINA, Io ANNO TESTO CONSIGLIATO: Strachan e Read (UTET) Genetica umana molecolare Docenti: Prof.ssaValeria Poli Prof. Ferdinando Di Cunto [email protected] [email protected] Dipartimento di Genetica, Biologia e Biochimica Sezione di Biologia Via Santena 5 bis (II piano) CALENDARIO LEZIONI (FINO A PASQUA) CANALE A: CANALE B: Marzo: Lu 24 Lu 31 Marzo: Mar 25 Aprile: Aprile: Mar 1 Gio 3 (ore 8:30) Lu 7 Mer 9 Mar 15 Mer 16 (ore 14-16) Mer 2 Mar 8 Gio 10 Lu 14 Mer 16 LUCIDI ESAMI - Introduzione: la biologia molecolare e le sue implicazioni in Medicina - La tecnologia del DNA ricombinante: Concetto di clonaggio e di genoteca Enzimi di restrizione Vettori plasmidici, virali e altro Sistemi per evidenziare gli acidi nucleici da campione biologico: Southern blot, Northern blot, PCR La PCR in diagnostica e per identificazione individuale e di relazioni di parentela (NB: Strachan, capitoli 4,5,6, 17.4) - L’organizzazione del genoma umano e la sua evoluzione L’organizzazione dei geni umani pseudgeni e frammento genici sequenze non codificanti sequenze ripetute ed elementi trasponibili (NB: Strachan, capitolo 7 + appunti) - Concetti e implicazioni del controllo dell’espressione genica: Schema riassuntivo del controllo trascrizionale di un gene eucariota. La cromatina nella regolazione della trascrizione (metilazione, acetilazione) Gli attivatori e i repressori trascrizionali: cosa sono, come agiscono meccanismi di imprinting Interferenze con l’espressione genica nelle patologie umane Gli inibitori delle acetil transferasi degli istoni nella terapia dei tumori (NB: Strachan, capitolo 8 + appunti) -Organismi transgenici e medicina animali transgenici (Strachan, capitolo 21 + appunti) •OGM in agricoltura e zootecnia (appunti) I progetti genoma e la loro importanza per la medicina Il progetto genoma umano Importanza dei progetti genoma degli organismi modello per la comprensione del genoma umano Era pre- e post-genomica (NB: Strachan, capitolo 13 + appunti) - L’identificazione dei geni patologici nell’uomo, patologia molecolare. Clonaggio posizionale Clonaggio funzionale Approccio del gene candidato Conferma del gene candidato Classi di mutazioni possibili (NB: Strachan, capitolo 15 e 21 + appunti) - Banche di dati genetici e genomici (NB: Strachan, XIX-XXIII + appunti) - Terapia genica Terapia cellulare e terapia genica Strategie terapeutiche Vettori virali e non virali Problemi etici (NB: Strachan, capitolo 22 + appunti) Clonazione degli organismi eucarioti e possibili applicazioni Clonazione di animali: come e perché? •La clonazione umana: perche’? •Prospettiva: combinazione della clonazione terapeutica con la terapia genica (NB: Strachan, capitolo 21 + appunti) SITI WEB UTILI • http://www.bios.co.uk: sito dell’editore, illustrazioni e esercizi (?) • http://www.whfreeman.com/biology/: lista di siti libri e link su internet • http://www.whfreeman.com/lodish/index.htm: estratto dal Lodish-Molecular Cell Biology • Esercizi interattivi • Esperimenti classici • Animazioni • Siti web correlati • http://www.biointeractive.org/: laboratorio virtuale • http://www.biology.arizona.edu/molecular_bio/molecular_bio.html: set di test interattivi e lezioni illustrative • http://www.zoo.utoronto.ca/able/hotsites/hotsites.htm: lista di siti “caldi” BIOLOGIA MOLECOLARE • Scienza che studia le molecole “della vita” (macromolecole) con lo scopo di integrarle nei fenomeni biologici oppure • Scienza che studia le macromolecole e come queste interagiscono per dare origine a fenomeni biologici • Base fondamentale per la tecnologia del DNA ricombinante e l’ingegneria genetica • La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano le interazioni tra macromolecole e il loro significato biologico passa attraverso la caratterizzazione della loro struttura primaria (sequenza). • La conoscenza della sequenza del DNA genomico, sia codificante che non, ci permette la catterizzazione della struttura dei geni e della struttura primaria delle proteine o degli RNA da loro codificati. TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE La tecnologia del DNA ricombinante • Clonaggio del DNA (DNA ricombinante) • Endonucleasi di restrizione • Ibridazione di acidi nucleici • Sequenziamento del DNA • Reazione polimerasica a catena (PCR) DEFINIZIONI • Complementarieta’: una sequenza nucleotidica S e’ la complementare di S’ se i due filamenti possono appaiarsi secondo la regola di Watson e Crick • Ibridizzazione: l’appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari • Tm (temperatura di fusione): temperatura alla quale il 50% di una certa sequenza nucleotidica e’ ibridizzata al suo filamento complementare. • Sonda: molecola di DNA o RNA a singolo filamento con una sequenza specifica, marcata e utilizzata per visualizzare la presenza della sua complementare tramite ibridizzazione. • Oligonucleotide:breve filamento di acido nucleico, che puo’ essere sintetico • DNA polimerasi: gruppo di enzimi che possono copiare una sequenza di • DNA sintetizzando il filamento omologo. Necessitano di un oligonucletide di innesco (primer) appaiato al filamento stampo DNA ligasi: catalizza la formazione di legame fosfodiesterico tra 2 molecole di DNA con estremità compatibili • Trascrittasi inversa: enzima che e’ in grado di copiare una molecola di RNA in una di DNA complementare • cDNA: copia in DNA dell’RNA messaggero Il clonaggio del DNA • Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace di replicarsi detto vettore). • Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall’ Escherichia coli). • Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata, permettendo di produrne quantita’ praticamente illimitate ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE -Nel 1970 Hamilton Smith ha isolato il primo enzima che taglia il DNA a livello di una sequenza nucleotidica specifica. -Endonucleasi di restrizione e metiltransferasi formano il SISTEMA DI MODIFICAZIONE E RESTRIZIONE dei batteri. -Le metiltransferasi metilano le basi del DNA appena sintetizzato -Sistemi di Restrizione e modificazione sono stati scoperti in molti batteri -In genere vengono metilati: C5 di anello citosina N4 di anello citosina N6 di anello adenina COSA SERVE AL BATTERIO IL SISTEMA DI RESTRIZIONEMODIFICAZIONE? A evitare infezioni da parte di fagi (se il loro DNA non è metilato nei punti giusti verrà tagliato) -Molti fagi hanno sviluppato un sistema di anti-restrizione TIPO II: Costituite da due subunità 1-metila il DNA 2-taglia FUNZIONANO ANCHE SEPARATE! RICONOSCONO SEQ PALINDROMICHE TAGLIANO ALL’INTERNO DI SEQ RICONOSCIUTE O A DISTANZA DEFINITA. UTILIZZATE PER MAPPARE E CLONARE IL DNA. ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II -Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4,6 o 8 nucleotidi). EcoRI BamHI E = co = R = I = genere Escherichia specie coli ceppo RY13 prima endonucleasi isolata G/AATTC CTTAA/G B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens G/GATCC H = ceppo H CCTAG/G I = prima endonucleasi isolata TIPO DI TAGLIO: -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es. SmaI 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’ -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: -5’ PROTRUDING -3’ PROTRUDING Es. Eco RI (5’ PROTRUDING) 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’ 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’ Es. Kpn I (3’ PROTRUDING) 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’ 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’ QUANTE VOLTE TAGLIA UN ENZIMA DI RESTRIZIONE? La maggior parte riconosce palindromi di 4 o 6 nucleotidi se assumiamo che i 4 nucleotidi siano distribuiti a caso nelle molecole di DNA: -per enzimi che riconoscono palindromi di 4 nt si avrà IN MEDIA un taglio ogni 256 nucleotidi (4x4x4x4). -per enzimi che riconoscono palindromi di 6 nucleotidi avremo IN MEDIA un taglio ogni 4.096 nucleotidi (46). Frammenti con estremita’ coesive complementari possono essere facilmente legati covalentemente EcoRI TaqI HindIII Le estremita’ coesive compatibili si appaiano, ei gruppi 3’-idrossilico e 5’-fosfato di 2 frammenti appaiati si trovano cosi’ ad essere adiacenti La DNA ligasi (derivata dal batteriofago T4) catalizza la formazione di un legame fosfodiestere tra i gruppi 3’-idrossilico e 5’-fosfato Clonaggio: vettori plasmidici I plasmidi sono molecole di DNA extra-cromosomali che si auto-replicano Sono presenti in natura in batteri, lieviti e alcuni eucarioti superiori, in uno stato di relazione parassitica o simbiontica verso la cellula ospite Molti plasmidi contengono caratteri (geni) che arrecano beneficio alla cellula ospite (es. resistenza a un antibiotico) Molti plasmidi sono in grado di auto-trasferirsi da una cellula all’altra. Clonaggio in vettore plasmidico generato tramite restrizione DNA ligasi Limiti del clonaggio in vettori plasmidici • Bassa efficienza di trasformazione e bassa densita’a cui si possono crescere le colonie • limitata capacita’ di contenuto ************** • uso di vettori derivati dal batteriofago l, particolarmente per l’analisi di librerie genomiche o di cDNA Il batteriofago l Vettori che possono contenere inserti più lunghi di 40 kb • BAC (bacterial artificial chromosome) >300 kb • PAC (basato sul fago P1) 85-100 kb • YAC (yeast artificial chromosome) fino a 2 Mb Le genoteche o librerie di DNA: –Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una certa specie (es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109 coppie di basi, che possono essere contenute in circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno) –Libreria di cDNA: collezione di cloni che include tutte le specie di mRNA (trascritte in cDNA) espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu’ rare Costruzione di una libreria genomica Costruzione di librerie genomiche utilizzando il fago l come vettore Costruzione di una libreria di cDNA Analisi dei cloni ottenuti • Crescita dei cloni, purificazione del DNA plasmidico e analisi con enzimi di restrizione • Sequenziamento Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi Visualizzazione dei frammenti separati per elettroforesi MAPPE DI RESTRIZIONE Mappare multipli siti di restrizione