Diapositive dalla lezione del 6.10.2006

PROGRAMMA
•Organizzazione della Cellula Eucariotica;
•Il Ciclo di Divisione Cellulare;
•Espressione dei Geni.
Un approccio multidisciplinare di tipo biochimico,
chimico e genetico risulta fondamentale per lo sviluppo
di tecniche dedicate a:
-Studio di popolazioni cellulari;
-Purificazione di acidi nucleici e proteine;
-Determinazione della struttura e dinamica molecolare
di acidi nucleici e proteine;
-Studio dei sistemi di trasmissione da cellula a cellula,
dal citoplasma al nucleo, ecc…
Che cos’è una CELLULA?
La Cellula è
l’Unità Elementare di Attività Biologica
Consideriamo un dispositivo costituito da
un recipiente contenente un certo numero
di cellule viventi in un ambiente costituito
da un terreno nutritizio liquido:
QuickT ime™ e un
decompressore T IFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
I Osservazione
•Le cellule sono capaci di sopravvivere e di
riprodursi;
•Il loro numero aumenta nel tempo;
•L’attività proliferativa continua finché non si
sono esaurite le risorse nutritive dell’ambiente
ed i prodotti di rifiuto non sono troppo
concentrati;
•Quando l’attività proliferativa si è arrestata,
può essere ripresa se la coltura viene diluita
con altro terreno fresco.
Curva di Crescita di Cellule di Mammifero coltivate in vitro
II Osservazione
A= Composizione chimica del terreno nutritivo
B= Composizione chimica delle cellule
A = B
La composizione chimica delle cellule è diversa
da quella dell’ambiente in cui si trovano
III Osservazione
A= Variazione della composizione chimica del
terreno nutritivo
B= Misurare eventuale variazione della
composizione chimica delle cellule
A = Variabile
B = Costante
CONCLUSIONI
•Le cellule devono essere delimitate da una
struttura che le separa dal mezzo ambiente
detta membrana cellulare o membrana
plasmatica;
•La barriera di permeabilità della membrana
non è assoluta, ma selettiva.
Definizione secondo
Loewy e Siekevitz, 1974
La cellula è un’unità fondamentale di attività
biologica, delimitata da una membrana dotata
di permeabilità selettiva, e capace di
autoriprodursi in un ambiente in cui non vi
sono altri sistemi viventi.
Modelli di Organizzazione
Cellulare
Modello
Procariote
Modello
Eucariote
Modello Procariote
•La parete cellulare costituisce una barriera porosa non
selettiva;
•La membrana cellulare è una barriera permeabile altamente
selettiva per l’ingresso della maggior parte delle sostanze;
•Il modello procariote è sprovvisto di compartimentazioni
interne;
•Vi è una semplice organizzazione dell’apparato
informazionale che è confinato in una distinta area nucleare;
•Grandissima capacità di adattamento alla sopravvivenza che
consente di superare rapidamente le modificazioni improvvise
delle condizioni ambientali;
•All’interno dei procarioti non ci sono ampie differenze;
•I procarioti non sono in grado di costituire organismi
multicellulari.
Modello Procariote
Q uickTim e™ e un
decom pr essor e TI FF ( Non com pr esso)
sono necessar i per visualiz zar e quest 'im m agine.
Modello Eucariote
•Questo modello è caratterizzato da un elevato grado di
compartimentazione interna;
•Il materiale informazionale è confinato al nucleo che a sua
volta è separato dal citoplasma da un involucro nucleare;
•Il citoplasma contiene numerosi organelli delimitati da
membrane e diversi per struttura, organizzazione e funzione;
•La possibilità di privilegiare l’una o l’altra delle funzioni
cellulari specifiche, consente il processo di
differenziamento;
•La specializzazione strutturale e funzionale comune a più
cellule consente loro di riunirsi in associazioni funzionalmente
integrate quali quelle rappresentate dagli organismi
multicellulari;
•Sono presenti anche organismi unicellulari come il lievito.
Modello Eucariote
Q uickTim e™ e un
decom pr essor e TI FF ( Non com pr esso)
sono necessar i per visualiz zar e quest 'im m agine.
Relazione tra Dimensioni del Genoma e Complessità Biologica
Metodi di Indagine della Cellula
I metodi di indagine possono essere suddivisi in:
•Metodi Analitici (Microscopia e Citometria)
•Metodi Preparativi (Centrifugazione,
Cromatografia, Agglutinazione e Cell Sorter)
CITOMETRO A FLUSSO
BANCO OTTICO = LASER E SENSORI
DEFINIZIONI
•Flow Cytometry
Misura le proprietà delle cellule in flusso
•Flow Sorting
Separa le cellule sulla base delle proprietà
misurate
Gli strumenti sono anche definiti:
Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS)
Fluidica
Ottica
•Consente alle cellule di passare
•In fila indiana attraverso
•Un volume illuminato (camera di
conta) in cui esse
•Disperdono (SCATTER) la luce ed
emettono fluorescenza
Elettronica
•Che è raccolta, filtrata e
•Convertita in valori numerici o digitali
•Che sono salvati in un computer.
SCATTER LATERALE =
X = Side Scatter = Right
Scatter = Scatter a 90°
LASER
Otturatore
Fotomoltiplicatore
SCATTER
FRONTALE = Y =
Forward Scatter =
Scatter a 180 °
Fotodiodo
Scatter Frontale=Scatter a 180°=Forward Scatter (FWSc) è
una MISURA della DIMENSIONI CELLULARI.
Scatter Laterale=Scatter a 90°= Side Scatter (SSC)=Right
Scatter (RTSC) è una
MISURA della COMPLESSITA’ INTERNA DELLA CELLULA,
ad es. Granulosità Intracitoplasmatica.
y
x
FSC
FALS Scatter
90 deg Scatter
90°SC
FLUOROCROMI
I fluorocromi sono molecole (in genere proteine) in grado di essere
eccitate ad una determinata lunghezza d’onda e di emettere luce ad
un’altra ben specifica lunghezza d’onda
Filtri Dicroici
I filtri dicroici sono dispositivi che, colpiti da un raggio luminoso,
sono in grado di far passare la luce caratterizzata da una certa
lunghezza d’onda e di rifletterla ad un’altra lunghezza d’onda
Bandpass Filter
Tali filtri permettono il passaggio di determinate lunghezze di
onda all’interno di un range e rigettano, senza rifletterle, quelle al
di fuori del range
Optical Design
PMT 5
PMT 4
Filters
Dichroic
Sample
PMT 3
Flow cell
PMT 2
Scatter
Sensor
PMT 1
Bandpass
Filters
Las
er
Common
Laser
Lines
350
300 nm
457 488 514
400 nm
500 nm
610 632
600 nm
700 nm
PE-TR Conj.
630
Texas Red
PI
Ethidium
575
510
PE
FITC
cis-Parinaric acid
FILEVERSION;1.15
BTRIEVE;7058418 IBA13-2 collected 6/27/95;28/6/1995;;2;1
PARAM;LS1;400;LS2;600;FL1;460;FL2;400;FL3;300;WID;TIM
GAIN;1;1;2;2;0
THRES;0;10;0;5;0;5;1;11;0;5
FLUIDIC;3;4;1;7.20
FCM;357;2;2;1;1;0;0;1;1;1;1;0;1;1;0;1
SUBTRACT;15;0
AUTOCYCLE;1;0;0;0;0;0;0;-1;1;20000;7;0;1;0;1;0
PCBUFFER;374000;1
SERIAL;2
ADBOARD;1;0;0;30;0
PEAKAREA;0;0;0;0
CALIBRATION;300;300;300;300;0;0;0;0
MAINWINDOW;1
PRINTHEADER; Flow cytometry Report;Win-Bryte software - Bryte-HS flow cytometer
PRINTFOOTER; Purdue University Cytometry Laboratories
PRINTSTATISTICS;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;1;0;0;1;20;15;1;8;12;5;0;0;5
ROI;1;1;3;3;4;45;65;61;65;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;bird;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0
ROI;2;1;3;3;0;121;41;141;41;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;human;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;0;255;0;0
ROI;7;3;5;1;0;0;18;24;63;52;48;16;2;0;2;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;0;;1;1;1;0;1;1;1;0;1;1;0;;-1;-1;3;5;255;0;0
ROIDATACYTO;7;20022;4845.7;98.7;0.0
ROIDATAHIST;1;2.4;16712;52;53;4044.6;2.4;53;83.5;0.0
ROIDATAHIST;2;2.2;1875;128;128;531.3;1.7;128;7.8;0.0
HISTOGRAM;FALS;24;49;290;320;256;0;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255
HISTOGRAM;SIDE-SCATTER;290;49;556;320;256;1;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;255;1;1;C;0;1;1;1;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;1;255;0;255
CYTOGRAM;LS1-LS2;24;320;290;591;64;1;0;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;O;0;1;0;0;S;0;6;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;6;-1;1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255
HISTOGRAM;FL2;290;320;556;591;256;3;Count;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;255;0;0;1;1;C;10;1;1;1;S;0;0;1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;0;7;-1;1;1;1;255;0;255
CYTOGRAM;FL2-TIM;556;320;822;591;64;6;3;1;1;0;0;0;255;0;255;0;0;0;0;0;0;1;1;I;0;1;0;0;S;0;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;-1;1;1;0;1;0;A;B;C;D;1;1;255;0;0;32;32;0;255;0;255
LISTDATA
226;0;426;426;243;81;0
412;225;8;426;426;239;0
380;262;2;427;427;245;0
578;348;0;412;412;239;0
529;377;0;431;431;240;0
420;203;0;438;438;243;0
444;221;0;427;0;240;0
383;215;0;421;421;238;0
735;716;0;1027;1027;280;0
499;228;0;431;431;239;0
531;328;0;433;433;241;0
520;218;0;423;423;243;0
471;252;0;425;425;244;0
652;298;0;441;441;240;0
561;291;0;421;421;240;0
608;307;0;415;415;241;0
541;231;0;424;424;245;0
Listmode File
Analisi dei quattro quadranti
4 (+ +)
log PE
3 ( - +)
1 (- -)
2(+ -)
FALS Scatter
Strategie di Gating
log PE
90 deg Scatter
1P Fluorescence
2P Fluorescence
…Back Gating…
In un campione di sangue periferico, noi possiamo
operare un gate su una putativa popolazione che per le
quelle date proprietà fisiche si identifica, per esempio, con
i linfociti. Comunque, può accadere che a quella data
putativa popolazione linfocitaria si sovrappongano altri
tipi cellulari. Mediante l’utilizzo di un marker di
fluorescenza che identificherà i putativi linfociti di
interesse, noi possiamo tracciare un altro gate sulla
regione positiva a quel dato marker e operando un
backgating, cioè re-impostando i parametri fisici sul gate
di fluorescenza, identificheremo soltanto le cellule
positive a quel dato marker di fluorescenza utilizzata.
Colture Cellulari
Tecniche Sterili o Asettiche
•Per impedire la contaminazione
accidentale dovute a microrganismi
provenienti da fonti esterne;
•Per impedire la contaminazione di se
stessi o di terzi.
Metodi di Sterilizzazione
•Sterilizzazione al calor rosso su fiamma;
•Sterilizzazione al calor secco mediante
l’utilizzo di un forno ad una temperatura di
circa 160°C per almeno 2h ed è’
particolarmente indicata per la vetreria di
laboratorio
•Sterilizzazione al calore umido mediante
l’utilizzo dell’autoclave a 121°C per almeno 15
min. E’ particolarmente indicata per mezzi
liquidi non sensibili al calore e della vetreria
di laboratorio dopo l’uso
Laboratorio di Colture Cellulari
•Area di Lavoro
•Abbigliamento di Laboratorio
•Reagenti Colturali e Vetreria
•Cappa a Flusso Laminare
Le cabine a flusso laminare verticale sono concepite
per la protezione del prodotto e dell'operatore
durante la manipolazione di materiale non patogeno.
Sono particolarmente indicate nel caso sia
preferibile non investire l'operatore con il flusso
d'aria proveniente dalla zona di lavoro
(manipolazione di sostanze allergizzanti o
potenzialmente tali, maleodoranti, finemente
polverose).
Tra le applicazioni più comuni rientrano la
manipolazione di prodotti che devono conservare la
sterilità, in particolare colture cellulari e materiale
biologico sterile, comunque sempre non patogeno,
nonché la preparazione e ricostituzione di farmaci.
CARATTERISTICHE:
•Flusso laminare verticale sul piano di lavoro;
•L'aria espulsa viene sottoposta a filtrazione
assoluta;
•La camera interna è di acciaio inox con
angoli arrotondati per facilitare la
disinfezione;
•L’apertura di lavoro è frontale
•E’ presente un sistema di allarme in caso di
imperfetto funzionamento dei
motoventilatori.
Cappa a Flusso Laminare di Classe II
Aria filtrata tramite filtri HEPA al
fine di proteggere il microambiente
da sostanze a rischio biologico
30%
70%
Pressione positiva e
flusso laminare
Campi d’applicazione: Microbiologia,
Virologia, Ematologia, Colture Cellulari e
DNA ricombinante.
I filtri HEPA consentono di eliminare le
varie sostanze a rischio biologico che
possono provenire sia dall’interno della
cabina di lavoro che dall’esterno con
un’efficienza del 99,995%.
Il flusso laminare e la pressione
positiva che si creano all’interno
della cappa consentono di ottenere
una barriera di protezione che
previene il contatto delle sostanze
dannose con l’operatore e quindi
anche con l’ambiente esterno.
Aria esterna
Il Ruolo di una Biomolecola
• In Vivo usando Singoli Animali
• In Vitro e quindi in un
Ambiente Artificiale
Colture a Breve Termine di circa 24h di
Tessuti o Organi
Richiesta di Soluti Inorganici
Soluzioni Saline Fisiologiche
Necessità di Ossigeno
Perfusione
Temperatura (37°C) e pH (7.2-7.5)
Differenti Tipi di Coltura di Cellule in Vitro
Coltura Primaria
Coltura Secondaria
Coltura Primaria
Coltura a Breve
Termine
Coltura a Lungo
Termine
< 10 duplicazioni
50/60
duplicazioni
Coltura Secondaria
Linea Cellulare Continua
>150/200 duplicazioni
Linea Cellulare Continua
•E’ capace di crescere
indipendentemente dall’organismo
originale da cui è derivata
•Crescita ininterrotta per oltre 1 anno
•Immortale
Linea Cellulare Continua
Subclone
• derivata dalla linea cellulare parentale, ma con
caratteristiche divergenti/uniche
Linee sorelle simultanee
• stabilizzate da differenti siti dello stesso organismo
• il campione primario è stato suddiviso in più aliquote prima
della semina
Linee sorelle seriali
• stabilizzate dallo stesso organismo, ma in differenti
momenti (ad esempio alla diagnosi ed alla recidiva)
Stabilizzazione di Nuove Linee Cellulari
•
Estremamente Difficile
•
Rari Successi e Non Prevedibili
•
Importanza delle Aberrazioni
•
Cromosomiche e/o Mutazioni
Genetiche
•
Diagnosi vs Ricaduta: diverse
percentuali di successo
Scarsa
riproducibilità
della metodica in
altri laboratori
The leukemia-Lymphoma Cell Line
FactsBook di H.G. Drexler, 2000.
IN VIVO
La pressione parziale di ossigeno nei normali fluidi
corporei è significativamente più bassa di quella
dell’aria.
Nel midollo osseo umano è di circa il 2-5%.
EX VIVO
Incubatore
La pressione parziale di ossigeno negli incubatori
al 5% di CO2 è di circa 15-20%!!!
In alcuni casi è utile ridurre la fase gassosa di
ossigeno tra 1-10%.
Alcune cell lines crescono al 5% di ossigeno ed il
6% di anidride carbonica
Deterioramento della Coltura
Possibili ragioni
• Le cellule neoplastiche cessano di proliferare
• Overgrowth di fibroblasti o macrofagi
• Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+
B
B
B
B
LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA
LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI
• Medium di coltura:
RPMI 1640, IMDM, McCoy’s, Alpha
MEM e DMEM
• Fattori di crescita:
EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6,
SCF, PHA e CM
• Supporto colturale (plastica)
• Concentrazione cellulare
• Superamento della crisi di
stabilizzazione
Medium di Coltura
“Ioni Inorganici”
Ioni Inorganici
Cloruro di calcio anidro
Solfato di magnesio anidro
Cloruro di potassio
Nitrato di potassio
Cloruro di sodio
Fosfato di sodio bibasico
Bicarbonato di Sodio
Medium di Coltura
“Aminoacidi-Isomeri L”
Alanina
Arginina
Asparagina
Acido Aspartico
Cisteina
Glutamina
Acido Glutamico
Glicina
Istidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Medium di Coltura
“Vitamine”
Biotina
Pantotenato
Acido Folico
Inositolo
Nicotinamide
Piridossina
Riboflavina
Tiamina
Vitamina B12
Medium di Coltura
“Altri Componenti”
Glucosio
Hepes
Rosso fenolo
Sodio - Piruvato
Siero fetale bovino (10 oppure 20%)
Aminoacidi non-essenziali
La membrana Plasmatica:
Individualità e Socialità della Cellula
(T. Alescio et al.)
SIGNIFICATO BIOLOGICO DELLA MEMBRANA
1. Isolamento;
2. Comunicazione;
3. Compartimentazione;
4. Integrazione funzionale intracellulare.
1.ISOLAMENTO
E’ una condizione necessaria a garantire l’individualità del
corpo cellulare e la sua integrità chimica; tale condizione
è fondata sulla capacità della membrana di comportarsi
come una vera e propria barriera selettiva.
•Ogni cellula mantiene una composizione chimica diversa
da quella dell’ambiente;
•Ogni cellula può mantenere la sua individualità genetica
e metabolica;
•Ogni cellula mantiene l’autonomia eventualmente
necessaria per la competizione dalla quale scaturisce il
processo evolutivo.
2. COMUNICAZIONE
Poiché ogni cellula rappresenta un sistema termodinamico
aperto, l’isolamento non può essere assoluto ed i sistemi di
comunicazione devono assolvere a 3 compiti:
•Consentire il passaggio selettivo, in direzione definita, di
sostanze nutritive e dei prodotti di rifiuto;
•Capacità di ricevere dall’esterno stimoli e segnali in
maniera tale da evocare gli eventi genetici e metabolici
adeguati che configurano risposte cellulari specifiche agli
stimoli ricevuti;
•Realizzare le connessioni intercellulari dirette ed
indirette necessarie ad assicurare la solidarietà funzionale
di tutte le componenti dell’organismo.
3. COMPARTIMENTAZIONE
E’ una condizione tipica degli eucarioti nei quali
l’esistenza di sistemi intracellulari di membrane
suddivide il corpo cellulare in una serie di scomparti
ciascuno dei quali può acquisire una propria attività
specializzata.
LISOSOMI
NUCLEO
4. INTEGRAZIONE FUNZIONALE INTRACELLULARE
La membrana plasmatica e le membrane intracellulari
svolgono la funzione di supporti utili per ancorare ed ordinare
in sequenze spaziali ben definite molecole destinate a
svolgere funzioni collegate ed interdipendenti
Quando gli enzimi E1, E2 ecc… si trovano in soluzione
nel citoplasma, la loro probabilità di incontro con il
rispettivo substrato è proporzionale alle loro
concentrazioni. La reazione può avvenire soltanto nel
momento in cui i movimenti disordinati di diffusione
entro la cellula, conducono all’interazione di substrati
ed enzimi.
Se invece gli enzimi E1, E2 ecc… sono strettamente
associati l’uno all’altro in un grande complesso
multienzimatico, la probabilità che il primo prodotto
intermedio, liberato da E1, incontri E2, che si trova
nelle immediate vicinanze, risulta molto maggiore.
Un’intelligente strategia biologica è
quella di inserire una sequenza di
molecole funzionalmente interdipendenti
nella compagine di un tratto di membrana
plasmatica o intracellulare; questa,
quindi, può offrire, nel caso del
complesso multienzimatico, la struttura
di supporto richiesta per la sua
integrazione funzionale.