TRASFEZIONE

CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008
TRASFEZIONE GENICA
TRASFEZIONE GENICA
 Trasferimento di DNA esogeno in cellule di
mammifero per lo studio della funzione e dei
meccanismi di controllo dei GENI
Perché trasferire nelle cellule frammenti di DNA esogeno?
• IN RICERCA:
a) cellule in coltura
– Identificazione di sequenze regolatorie
– Struttura e funzione genica
– Produzione di proteine
• Studio
• Farmaci
b) IN VIVO: produzione di animali transgenici
• Modelli per la comprensione delle basi molecolari di
malattie umane
• IN PRATICA CLINICA: TERAPIA GENICA
– Ripristino di funzioni metaboliche deficitarie
– Aumento delle difese naturali
Il trasferimento genico
• Tipi cellulari:
Non tutte le cellule possono essere trasfettate con successo
– Processo in sé inefficiente
– Necessaria una fonte abbondante di cellule di partenza
per ottenere un numero utilizzabile di cellule trasfettate
– Linee cellulari immortalizzate
- Crescita in medium chimicamente definito per tempo
indefinito
- Rapida duplicazione
MCS
• Vettore
– PLASMIDE
– VIRUS (infezione)
• Promotore:
– Corte sequenze nucleotidiche
– Danno inizio alla trascrizione
– Enhancer: elementi di regolazione positiva
• Derivati da virus
– SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi cellulari
– LTR: long terminal repeat
» Raus Sarcoma Virus
» CMV
– Silencer: elementi di regolazione negativa
• Fattori per la replicazione: cis, trans
• ORI: sito di inizio della trascrizione (in genere SV40)
Che tipo di trasfezione?
• TRANSIENTE:
- per esperimenti a breve termine (analisi ICC, studio del promotore…)
-
le cellule sono normalmente raccolte 48-72 h dopo la trasfezione
over-espressione genica
popolazione cellulare disomogenea: poche cellule con molto plasmide
immediata
• STABILE:
- per esperimenti a lungo termine
 possibilità di isolare e propagare singoli cloni contenenti il DNA trasfettato
- il plasmide si integra nel genoma, processo lungo e laborioso
- l’integrazione è casuale
- necessario marker di selezione (morfologia, resistenza a sostanze…)
- popolazione cellulare omogenea: molte cellule con poco plasmide
Scopo della trasfezione
1. Indagini sulla funzionalità di un gene
• PROMOTORE STD + GENE D’INTERESSE
2. Controllo dell’espressione genica: indagini sulla regolazione del
promotore
• PROMOTORE DEL GENE D’INTERESSE + GENE REPORTER
1. Studio attività-funzione di una proteina
- promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina
2. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless
Promotore + reporter
Enhancer + Promotore + reporter
Promotore deleto + reporter
Promotore con inserzione + reporter
GENE REPORTER:
permette immediata identificazione delle cellule positivamente trasfettate
• Mk di selezione:
Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore
– Creazione di linee stabili
• Reporter :
Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche
– Funzionalità di un promotore:
• reporter posto sotto il controllo di quel promotore
– Funzionalità di un gene:
• Fusione del gene d’interesse con il gene reporter
• Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso promotore
Caratteristiche di un reporter
• non deve avere un’attività proteica SIMILE a quella del gene
d’interesse
• l’attività proteica del Reporter non deve INTERFERIRE con
quelle fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il
metabolismo cellulare devono rimanere integri
• il saggio sull’attività del reporter deve essere specifico,
riproducibile e immediato
geni reporter
• Cloramfenicolo acetil-transferasi:
– Enzima batterico: resistenza all’antibiotico cloramfenicolo
– Acetilazione del Cloramfenicolo
– Se si usa come substrato l’antibiotico marcato con C14, viene
acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che
controlla l’enzima è attivo. Si produce una miscela di molecole
marcate rilevate su TLC o autoradiografia
Esempio: ANALISI TLC
• IL Clone A non ha attività acetilasica
• I Cloni B e C hanno attività acetilasica
geni reporter
• ß-galattosidasi:
– Codificato dal gene LacZ di E.coli
– Conversione di alcune sostanze in composti colorati
• Citochimica: clivaggio del substrato XGal → comparsa di
precipitati BLU (colonie blu)
• Spettroscopia: clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-Dgalactopyranoside ) → composto solubile giallo
• Luciferasi:
luciferina + ATP
luciferil eadenilate + O2
luciferil adenilato + PPi
ossiluciferina + AMP + LUCE
HSV TK promoter
AR ± T
R Luc+
pRL-TK
plasmide
PRE HSV TK promoter
F Luc+
pPRE-TK-luc
reporter plasmide
ori
ori
YY reagent
SV40 late
poly(A) signal
Firefly
Luciferase
XX reagent
T-inducible
luminescence
Dual system
SV40 late
poly(A) signal
-
Renilla
Luciferase
constitutive
luminescence
geni reporter
• GFP: green fluorescent protein
– espresso nella medusa Aequorea Victoria
– in natura produce bioluminescenza dovuta al trasferimento di
energia (processo Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina)
– l’esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce
autofluorescenza di colore verde in assenza di Ca, Aequorina o
qualunque cofattore o substrato
– mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che
emettono luce a differente lunghezza d’onda
• CFP (cyan, colore blu)
• YFP (yellow, colore giallo)
QuickTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Qui ckTime™ e un
decompr essore TIFF (Non compr esso)
sono necessar i per visual izzare q uest' immag ine.
QuickTi me™ e un
decompressore TIFF (N on compresso)
sono necessari per visual izzar e q uest' immag i ne.
Sito di poliadenilazione
• RNApolII trascrive anche il sito di poliadenilazione,
parte della porzione 3' viene rimossa e l'RNA poliadenilato.
• Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori
di espressione degli eucarioti per avere la sintesi di mRNA
• Due
elementi
indispensabili
per
corretta
POLIADENILAZIONE
– sequenze ricche di GU o U downstream il sito di
poliadenilazione;
– sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate 11-30
nucleotidi upstream il sito di poliadenilazione
Clonaggio di un gene in un vettore
METODI DI TRASFEZIONE
• CARATTERISTICHE:
– Elevata efficienza
– Bassa tossicità
– Riproducibilità in vitro e in vivo
• PROCESSO:
–
–
–
–
Introduzione del DNA nella cellula
Ottenimento dell’espressione del gene d’interesse
(selezione delle cellule che si sono trasfettate stabilmente)
Caratterizzazione del gene/ proteina prodotta
• PROBLEMATICHE:
– Come superare le barriere naturali???
• DNA: fortemente POLARE (carica negativa)
• MEMBRANA CELLULARE LIPOFILA
METODI DI TRASFEZIONE
1) METODI CHIMICI
2) METODI FISICI
Metodi chimici
• CALCIO FOSFATO
• Il DNA a contatto con una soluzione di
fosfato di calcio forma dei precipitati i
quali, con un meccanismo poco noto
(probabilmente per endocitosi)
entrano nelle cellule
• Gli ioni bivalenti possono promuovere
l’ingresso di acidi nucleici attraverso le
membrane.
• VANTAGGI
• SVANTAGGI
• Economico
 Tecnicamente delicato
• Relativamente versatile
- forma e dimensioni del precipitato
- influenzato da variazioni anche
minime di pH
 Efficienza bassa
 Elevata Citotossicità
 Non funziona con alcuni tipi cellulari
Metodi chimici
• DEAE-DESTRANO:
• il primo metodo usato per l’introduzione di DNA nelle cellule eucariote
• DESTRANO: Polisaccaride costituito da unità di D-glucosio legate
mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a
gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di
legare il DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane.
• Le cellule vengono trattate con glicerolo o DMSO (shock osmotico)
• VANTAGGI
 Molto semplice
• SVANTAGGI
 Molto poco efficiente
 Solo transfezioni transienti
Metodi chimici
• LIPOSOMI:
• misto di lipidi policationici e neutri, permette la
formazione di vescicole liposomiali unilamellari
che portano una carica netta positiva
• La testa cationica del composto lipidico si
associa ai gruppi P negativi dell’acido nucleico
• I complessi lipidi- DNA si fondono con le
membrane
cellulari
e
rilasciano
spontaneamente il loro contenuto nelle cellule
• VANTAGGI:
 Bassa tossicità
• SVANTAGGI
 Difficile produrre liposomi
 Alta variabilità
Esempio: LIPOFECTAMINA
• I lipidi cationici formano dei
liposomi, con una superficie
carica
positivamente
che
consente l’associazione del
DNA e media l’interazione con
la
membrana
plasmatica
(carichi negativamente)
• Molecole formate da una coda
policationica (DNA) e da una
porzione lipidica (membrana)
•VANTAGGI
Semplice
Efficiente
Poco tossico
•SVANTAGGI
Condizionato
dalla
presenza di siero o
antibiotici
Esempio: LIPOFECTAMINA
reagenti e metodo
• Transferrina
– Aggiunto al mix liposoma-DNA
– Ligando che funziona da AGENTE DIREZIONANTE, grazie alla sua
affinità con recettori di membrana, facilita l’interazione e l’ingresso
del complesso
– Non specifico (come insulina…)
Reazione cellulo-specifica: Ab-Ag
•
•
•
Un giorno prima : piastratura delle cellule
– Devono arrivare a una confluenza del 50-80%: ottimizzazione della densità cellulare
Trasfezione
– Diluire il DNA in medium PRIVO di siero e antibiotici
– Aggiungere la Transferrina (Tf)
– Lasciare reagire 15 min
– Diluire la Lipofectamina in D-MEM privo di siero
– Aggiungere la Lipo al DNA+Tf
– Lasciare reagire 15 min
– Cambio medium:
• Eliminare dalle piastre il medium di crescita
• Aggiungere medium privo di siero e Ab (metà del volume)
– Gocciolare il mix Lipo-DNA-Tf sulle cell
– Lasciare reagire 3h
– Rabboccare con D-MEM + siero (in proporzione doppia) + Ab
Il giorno dopo: cambio medium e trattamenti
Metodi fisici
• ELETTROPORAZIONE:
Le cellule vengono poste in una soluzione
contenente DNA, e vengono esposte ad un
breve
impulso
elettrico
che
produce
transitoriamente dei pori nelle loro membrane
VANTAGGI
 Può essere utile per quei tipi cellulari in cui non si
ottengono risultati con i metodi classici
 Il DNA entra direttamente senza passare attraverso
il compartimento endosomiale dove può aver luogo la
degradazione dell’acido nucleico
SVANTAGGI
 Necessità di ottimizzare le condizioni del campo
elettrico -intensità e durata Elevato livello di tossicità (50%)
Metodi fisici
• MICROINIEZIONE:
il DNA viene inserito nella cellula -nel citoplasma o nel nucleo- attraverso
un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione.
Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di mm di diametro)
la microiniezione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende:
• un microscopio,
• un micromanipolatore
• un iniettore
VANTAGGI
 effettuare il trasferimento
selettivamente nel citoplasma o nel
nucleo
 aumenta efficienza di espressione
 modulare facilmente il livello di
espressione
SVANTAGGI
 Tecnicamente impegnativa
 Poche cellule alla volta
 COSTOSO
Metodi fisici
• GENE GUN:
• Usa una pressione regolabile ad elio per sparare microcarriers d’oro
rivestiti di DNA sulla parete interna di una cartuccia di plastica
direttamente sul bersaglio
• Sistema per accelerare microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di
DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto
VANTAGGI
 Possibilità di lavorare in situ
 Applicabile a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier per il
trasferimento genico anche in vivo
 Possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni fisiologiche:
• espressione tessuto specifiche
• studi sullo sviluppo
 Possibilità di usare meno DNA e meno cellule di partenza
SVANTAGGI




Trattamento invasivo
Efficienza fortemente dipendente dal tipo cellulare
Molti parametri da controllare
COSTOSO
OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO
• DNA da trasfettare
– Privo di contaminanti: proteine/ RNA
– Soluzione sterile
• TIPO DI CELLULE
• TIPO DI VETTORE
– Adatto per aumentare l’espressione in linee cellulari di mammifero
• TEMPO DI TRASFEZIONE
– Da 30 min a 4 ore
• TIPO DI TERRENO DI COLTURA
– Effetto di siero e antibiotici
APPLICAZIONI
• SILENZIAMENTO GENICO
• SISTEMI INDUCIBILI
1) RNA interference (RNAi):
• processo post-trascrizionale presente in molti organismi e tipi cellulari
• mediato da corte molecole di RNA (‘short interfering RNA’ o siRNA)
• provocano degradazione dell’mRNA con sequenza complementare
--> “silenziamento” gene-specifico
• scoperti altre forme di RNA silenziatori: microRNA
• esistono forme endogene e forme esogene
endogeni: sintetizzate molecole di preRNAi da trascrizione di geni nucleari
“non-protein-coding-genes”, servono per regolazione fine del ‘pool’ proteico in
ogni fase del ciclo cellulare e ruolo in funzioni biologiche (difesa antivirale,
silenziamento dei centromeri, riarrangiamenti cromosomici e silenziamento
“trasposoni”)
esogeni: molecole potenzialmente dannose provenienti da fasi d’infezione
virale o frammenti di RNA di sintesi chimica, iniettati nella cellula
• sfruttati in ricerca e come potenziali agenti terapeutici
Small interfering RNA (siRNA):
• “silenziatori genici”
• originano da molecole dsRNA più lunghe
rascritte da geni codificanti per prodotti non
proteici
• nel citoplasma dsRNA vengono riconosciuti
da Dicer (complesso multienzimatico con
attività RNAsi III simile)
• si originano frammenti di 19-23 nt, i siRNA
a doppio filamento
• siRNA-ds vengono inglobati in complesso
ribonucleoproteico RISC (RNA-Induced
Silencing Complex) attivato dallo
svolgimento della doppia elica di siRNA
• RISC attivo riconosce mRNA con sequenza
perfettamente complementare alla sequenza
del siRNA legato
• degradazione mRNA e conseguente
--> ‘silenziamento sequenza-specifico’
microRNA (miRNA):
• piccole molecole non codificanti di RNA
• RNA a singolo filamento di 19-23 basi
• conservati durante l’evoluzione, identificati
in diversi organismi tra cui uomo, nematodi,
moscerino della frutta e piante
• originano da lungo dsRNA, processati da
Dicer che utilizza precursori di 70-100 basi a
forma di ‘forcina’ (hairpin)
• miRNA di 19-23 basi vengono legati da un
complesso simile a RISC
• specificità d’appaiamento enzima-miRNA e
mRNA target determina destino target:
a) poco specifico: legame tra miRNA e
target avviene al 5’UTR del mRNA --> non si
lega apparato traduzionale ma mRNA non
viene degradato
b) altamente specifico: mRNA viene
degradato
• numero di geni target dei miRNA è
maggiore di quello dei siRNA
APPLICAZIONI:
• controllo mirato e studio dell’espressione genica: è infatti possibile spegnere geni
specifici sia in colture cellulari che in modelli animali
• applicazioni anche nelle analisi di genomica funzionale
• applicazioni di tipo terapeutico: inibire oncogeni correlati a tumori prodotti in seguito a
traslocazioni cromosomiche o mutazioni puntiformi.
• inibizione della replicazione virale in colture cellulari.
STRATEGIE SPERIMENTALI:
• a differenza di quanto accade per le celule vegetali, in C. elegans e in Drosophila, nelle
cellule animali l’ingresso di dsRNA di lunghezza maggiore di 30 nt può scatenare un
processo di degradazione del filamento medesimo (meccanismo di difesa della cellula contro
frammenti di genoma virale).
• quindi si utilizzano direttamente i siRNA (dsRNA di l<25nt) che vengono direttamente
assemblati nel complesso RISC.
• siRNA possono essere: sintetizzati chimicamente
trascritti in vitro e poi introdotti nella cellula mediante trasfezione
iniettati in topi o inseriti in piante
• modificazione della tecnica: RNA interference DNA diretta (ddRNAi)
ddRNAi:
• permette uso di RNAi per silenziamento genico a scopo terapeutico e per lo screening di
interi genomi
• si basa su:
a) azione di promotori per l’RNA pol III e per RNA pol II per l’espressione di specifiche
sequenze di siRNA trasfettate in cellule di mammifero
 permette di utilizzare DNA templati che permettono la sintesi di dsRNA corti in vivo,
strutturalmente equivalenti ai siRNA attivi sintetizzati in vitro
b) in alternativa si può usare uno ‘short hairpin RNA’ (shRNA), cioè RNA costituito da
sequenza omologa a mRNA da silenziare, un loop, ripetizione invertita della sequenza
target
2) I sistemi inducibili
• permettono di regolare l’espressione di un gene
• richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare
• permettono di studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee
cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene:
- mantenuto “spento” in propagazione
- “acceso” al momento dell’esperimento
Protocollo per una trasfezione stabile:
• prima della trasfezione determinare la concentrazione a cui usare l’agente selettivo
• è necessario trasfettare oltre al gene di nostro interesse anche il gene che conferisce
la resistenza all’agente selettivo
• trasfettare anche cellule, come controllo, senza il gene della resistenza
• per circa 14 gg cambiare il medium e aspettare che muoiano le cellule non
trasfettate (non resistenti) o che non hanno integrato stabilmente il plasmide (che
altrimenti viene perso dopo un certo numero di divisioni). Nella coltura di controllo le
cellule devono morire
• quando si iniziano a vedere “isole” di cellule resistenti, trasferire i singoli cloni in
MW96 e continuare con lo screening
Geni per markers selettivi:
Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro
interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide.
• timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina. Si
selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In
un terreno –timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide.
- sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il
nostro studio
• aminoglicoside fosfotransferasi (Neo): conferisce resistenza agli
antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…).
Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare
le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche
le cellule trasfettate necessario determinare la dose appropriata.
• igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza all’igromicina (Hyg)
• asparagina sintetasi
• xantina-guanina fosforibosil transferasi
Lac system:
• sistema di repressione batterico.
• scoperto negli anni’50 all’Istituto Pasteur di Parigi da F. Jacob e J. Monod, studiando l’eredità dei
geni che controllano il metabolismo del glucosio e di altri zuccheri in E.coli.
Operone Lac: tre enzimi codificati dalla stessa unità trascrizionale
- lacY  permeasi necessaria per ingresso
del lattosio nella cellula
- lacZ  beta-galactosidasi che converte
lattosio in glucosio e galattosio
- lacA  tiogalattoside transacetilasi,
non richiesta per metabolismo
del lattosio
Controllo da parte del repressore lac (gene lac I)
separato dall’operone e sintetizzato in forma attiva;
si lega sul promotore (operatore) e impedisce
trascrizione dell’intero operone.
- lac  lacI attivo  blocco trascrizione
 Gli enzimi della via metabolica non sono
sintetizzati se non richiesti
+ lac (o analogo IPTG)  lacI viene inattivato
 trascrizione dell’intero operone
Plasmide pGEX:
- contiene proteina GST con a valle un
sito di taglio per la trombina
- regolato da promotore “tac”,
promotore ottimizzato artificialmente,
derivante dalla fusione del lac promoter
operon con parte del promotore
dell’operone trp (triptofano)
- Mantiene inducibilità da IPTG, ma
presenta livelli di espressione assai più
alti rispetto al lac normale
 produzione di grosse quantità di
proteina, purificabile mediante GST
GST
Promotore lac
AR
Trombine
cleavage site
AD+polyQ
LBD
MATRICE
RESINA
GLUTATIONE SEPHAROSE 4B
Sfere di diametro 45-165µm
Spaziatore di 12 atomi
legato a glutatione
(glicina, glutammato,
cisteina)
Chimera
GST-AR
TROMBINA:
Taglio proteolitico
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser
AR libero
+
GST legato
Tet system: TET-ON e TET-OFF
Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox).
Tet-On: l’aggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene
Tet-Off: l’aggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene
Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline:
Tet R= tet repressor protein: regola negativamente l’espressione dei geni
coinvolti nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla
sequenza Tet O=tet operator e blocca la trascrizione.
Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata:
- tTA= Tc-controlled trans activator: proteina ibrida (37 kDa) ottenuta
dalla fusione dei primi 207 aa di Tet R con 127 aa del C-ter dell’activator domain
VP16 di herpes simplex virus diventa attivatore trascrizionale in presenza di Dox
- rtTA= reverse tTA: proteina ottenuta modificando 4 aa di Tet R; ha
comportamento opposto a tTA in risposta a Dox
TET-ON  rtTA
TET-OFF  tTA
Il gene che vogliamo regolare
deve essere inserito a valle di una
sequenza TRE= Tc responsive
elements, sequenze di 42 bp che
contengono sequenza Tet O.
L’espressione basale del promotore
è molto bassa in assenza di Tc.
Tet-On vs Tet-Off:
I due sistemi sono complementari.
• nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc
o Dox nel medium per mantenere lo stato
inattivo. Le due molecole però hanno emivita
breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni
circa 48 h per reprimere l’espressione del gene X.
• il sistema Tet-On è responsivo solo alla Dox,
mentre Tet-Off è sensibile a entrambi.
• le concentrazioni di Tc o Dox necessarie sono
molto basse, inferiori a dosi citotossiche (sia per
colture cellulari che per animali transgenici)
• in entrambi i casi sono necessarie due
trasfezioni stabili consecutive: il plasmide
regolatore e successivamente pTRE-gene X
1^trasfezione stabile:
1.
piastrare cell e lasciarle crescere fino a circa
80% di confluenza
2.
trasfezione con vettore pTet On/Off
plasmide può essere linearizzato per
aumentare efficienza di integrazione
3.
permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e
quindi aggiungere agente selezionante
(G418, 400-500 ug/ml)
4.
cambio medium ogni 48 h o quando
necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che
non hanno preso la resistenza iniziano a
morire
5.
dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le
colonie singole. Isolare le singole colonie e
trasferire ognuna in una well
6.
screening: trasfezione con plasmide
reporter, ex: pTRE-luc che contiene gene
per la luciferasi di lucciola regolato da
sequenza TRE
7.
selezione delle colonie migliori (maggior
differenza indotto-non indotto)
8.
congelare stock dei cloni positivi
Trasfezione transiente preliminare:
I cloni stabili positivi ottenuti nella 1^trasfezione vengono trasfettati in
transiente con il plasmide pTRE-gene X per verificare l’effettiva
regolazione genica sul costrutto che si vole trasfettare stabilmente.
L’analisi della regolazione può essere effettuata con diverse tecniche:
- Western Blot
- RT-PCR
-saggio funzionale per la proteina X
- […]
2^trasfezione stabile:
1.
piastrare cell stabili per pTet On/Off e
lasciarle crescere fino a circa 80% di
confluenza
2.
Co-trasfezione con vettore pTRE-gene X e
pTk-Hyg (10:1). I plasmid pòssono essere
linearizzati per aumentare efficienza di
integrazione
3.
permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e
quindi aggiungere agente selezionante
(igromicina B, 200-400 ug/ml) e Dox nel
caso del sistema Tet-Off
4.
cambio medium ogni 48 h o quando
necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che
non hanno preso la resistenza iniziano a
morire
5.
dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le
colonie singole. Isolare le singole colonie e
trasferire ognuna in una well
6.
screening: verificare espressione gene X,
utilizzare la stessa tecnica usata nel
controllo della trasfezione transiente
7.
selezione delle colonie migliori (maggior
differenza indotto-non indotto)
8.
congelare stock dei cloni positivi
 lo scopo è quello di generare una linea stabile che abbia un basso
background e alti livelli di espressione della proteina X quando indotta
(differenza di almeno 20 volte)
 livelli di espressione e induzione possono risentire del sito d’integrazione
(ex: se integrazione avviene vicino a degli enhancer si può avere un aumento
del livello di espressone basale). Per questo motivo è meglio screenare il
maggior numero di colonie possibili per identificare quelle con le migliori
caratteristiche
 se il plasmide pTRE non contiene un marker di selezione è necessaria cotrasfezione ad ex con plasmide pTk-Hyg.
pTRE-gene X: pTk-Hyg 10/20:1 per aumentare probabilità che vengano
acquisiti entrambi i vettori dalla cell e non solo quello della resistenza
esempio: NSC34-Tet Off