ingegneria genetica

INGEGNERIA GENETICA
INDICE
• Nozioni generali su
DNA
• HNPCC (
Hereditary nonpoliposys colon
cancer )
• Referto genetico
• Bibliografia e
Linkografia
NOZIONI GENERALI SUL
DNA
• Il Dna è il materiale genetico che gli organismi
ereditano dai loro genitori
• E’ una macromolecola composta da due catene
avvolte a doppia elica di nucleotidi
•Un nucleotide è formato da una molecola di
deossiribosio, un gruppo fosfato e una base
azotata
•Le basi azotate del Dna sono quattro: la timina e
la citosina hanno una struttura ad anello singolo e
sono dette pirimidine;l’adenina e la guanina
hanno una struttura a doppio anello e sono dette
purine
Al fine di mantenere i due filamenti di
Dna a distanza costante una Timina è
sempre associata a un’Adenina; e una
Citosina è sempre legata a una
Guanina
Ogni tripletta di basi azotate codifica
per un’amminoacido ( attraverso la
trascrizione e la traduzione )
Il Dna all’interno del nucleo si trova
più volte ripiegato, in modo da poter
contenere una maggiore quantità di
informazioni. Il primo livello di
ripiegamento avviene grazie
all’utilizzo di un gruppo di 8 istoni, il
cui complesso prende il nome di
nucleosoma
HNPCC ( Hereditary nonpolyposis cancer colon )
Associato a tumori al
l’endometrio,
all’utero,all’intestino
tenue e ai reni.
Possibile
relazione tra il
sistema MMR e
le stazioni di
controllo G1/s e
G2/M della
riproduzione
cellulare
Amsterdam criteria I:3 parenti stretti in 2
generazioni devono avere manifesto
questo tipo di cancro sotto i 50 anni
SINROME di
DEFICIENZA del
MMR(mismatch
repair ) SYSTEM
Può essere dovuto anche ad
una non attivazione dei geni
come conseguenza di:
ipermetilazione del promotore,
perdita dell’eterozigosità,
nutazioni somatiche
Gran parte delle
mutazioni riguardano
i geni MSH2 e
MSH1, che
producono proteine
indispensabili per
MMR
MSI
REFERTO GENETICO
• ESTRAZIONE DEL
DNA
• PURIFICAZIONE
• PCR
• Replicazione del dna
nelle cellule
• SOUTHERN BLOT
• SEQUENZIAMENTO
• Grafico
• Il Codice Genetico
ESTRAZIONE DEL DNA
Ci sono tre procedimenti principali nell’estrazione del DNA.I dettagli
invece possono variare a seconda del tipo di campione e a seconda
delle sostanze presenti, che possono interferire con l’estrazione e le
successive analisi:
1. Demolizione della struttura cellulare e rimozione dei lipidi delle
membrane attraverso l’azione di un detergente.
2. Digestione delle proteine, in particolare degli istoni, aggiungendo
l’enzima proteasi, o attraverso la precipitazione tramite sodio o
acetato di ammonio, oppure utilizzando l’estrazione con fenolocloroformio.
(La digestione delle proteine è la loro demolizione fino ad
amminoacidi)
3. Precipitazione del DNA in freddo etanolo o in isopropanolo.Il Dna
è insolubile nell’alcol e si lega con quest’ultimo; in questo modo
vengono rimossi anche i sali.
REFERTO GENETICO
PURIFICAZIONE DEL DNA
•
•
La purificazione è necessaria prima di
effettuare la PCR in modo da avere dentro la
provetta solo il dna del paziente in soluzione
Per effettuarla vengono utilizzati determinati
kit preconfezionati i cui principali step sono:
1. Diluire la soluzione con Elution Buffer
2. Centrifugare in modo tale che il dna
scenda nella provetta (n.4,fgr)
separandosi dagli altri componenti e da
eventuali impurità
REFERTO GENETICO
PCR ( Polymerase chain
reaction ) COMPONENTI:
•La PCR è un metodo alternativo che permette
di ricavare un numero indefinito di copie del
dna di interesse , senza i tagli e le ricuciture
tipici del clonaggio, purché se ne conosca
almeno in parte la sequenza
•Il principio base della PCR, che le conferisce
andamento esponenziale, è quello di utilizzare
del filamento prodotto in un ciclo come
stampo per il ciclo successivo
•Per evitare che l’enzima si denaturi e debba
essere aggiunto ad ogni ciclo, è molto utile la
dna polimerasi termostabile di un
microrganismo termostabile, come il Thermus
Acquaticus
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gDNA
Taq polimerasi
Buffer
MgCl2
FW-RV primers
H2O
dNTPs
DMSO100%
REFERTO GENETICO
Replicazione del Dna nella cellula
•E’ importante sottolineare l’utilizzo di pochi fattori nella PCR
rispetto a quelli impiegati in una normale replicazione del dna
all’interno di una cellula, come avviene nel clonaggio del DNA
REFERTO GENETICO
SOUTHERN BLOT
• E’ un tipo di elettroforesi su gel che permette di identificare le
dimensioni dei frammenti di dna
• Si immerge il gel ( TBE 10x;Agarosio 2%;Bromuro di etidio),
munito di pozzetti, nella soluzione di TBE 10x
• All’interno dei pozzetti viene inserito il dna marcato e un marker
• Applicando una ΔV di 100 V tra i due elettrodi il dna migra verso il
polo positivo e si posiziona tra le maglie del gel a seconda della sua
lunghezza
• Infine la posizione in cui la sonda si
ibrida sul blot può essere rilevata con
una serie di film sensibili alla luce o agli
elettroni emessi dal dna marcato
REFERTO GENETICO
REFERTO GENETICO
SEQUENZIAMENTO
• L’obiettivo del sequenziamento è
quello di determinare l’ordine dei
nucleotidi in un gene
• Viene utilizzato un solo primer e
quindi solo un filamento viene
copiato
•Alla fine vengono fatti correre i
filamenti, di diverse lunghezze che
terminanti con un ddNTP marcato,
su un gel di poliacrilamide che
può separare molecole che
differiscono si una sola base
•Analisi del dna tramite un
spettrografo
REFERTO GENETICO
Grafico del sequenziamento
SEQUENZIAMENTO
IL CODICE GENETICO
REFERTO GENETICO
BIBLIOGRAFIA E
LINKOGRAFIA
• Päivi Peltomäki, Deficient DNA mismatch repair: a common
etiologic factor for colon cancer,Oxford University Press,15
gennaio 2001
• R. L. Nussbaum-R. R. McInnes-H. F. Willard,Thompson &
Thompson Genetics in Medicine,Saunders,2004
• G. Gibson-S.V. Muse, Introduzione alla Genomica, Zanichelli,
Bologna 2004
• www.molecularlab.it
• www.macgn.org