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PCR Polymerase Chain Reaction GENOMA UMANO: CIRCA 35.000 GENI OTTENERE MOLTE COPIE DELLA STESSA SEQUENZA La PCR è una tecnica biomolecolare che permette di copiare in vitro, in maniera esponenziale, una sequenza d’interesse. CLONAGGIO VETTORE: molecola di DNA che permette l’amplificazione della sequenza d’interesse PCR Miscela composta da: - Stampo - DNA pol - dNTP - Tampone - MgCl2 Replicazione del DNA 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ Filamento stampo DNA pol 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTAC GCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTT TAGCTAA-5’ Innesco (primer) Innesco (primer) 5’-AAGTCGCCGTA AATGCGTACTGTTGCA TGCGTAAATGCGCCC TGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ DNA pol Filamento stampo POLIMERASI DNA polimerasi usate nella PCR: DNA polimerasi DNA-dipendente Nelle prime versioni della tecnica si utilizzava la polimerasi termolabile DNA pol I di E. Coli. oggi si utilizzano polimerasi termostabili Taq polimerasi: estratta del batterio termofilo Thermus aquaticus non ha proofreading (3’-5’ esonucleasi) (correzione di bozza) bassa fedeltà Pfu polimerasi: estratta dal batterio ipertermofilo Pyrococcus furiosus presenta proofreading (3’-5’ esonucleasi) (correzione di bozza) alta fedeltà INNESCHI Inneschi (primers): Le DNA polimerasi hanno bisogno di una doppia elica di DNA, l’appaiamento dell’innesco con lo stampo fornisce la doppia elica e l’estremità 3’ OH a cui aggiungere i nucleotidi. Progettazione degli inneschi (primers): definizione della loro sequenza. È tra i fattori che maggiormente influenzano l’efficienza della reazione. 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTGTTGCATGCGTAAATGCGCCCTGAAATCGATT-3’ 3’-AACGT-5’ 3’-AGCTA-5’ 5’-TCGCC-3’ 5’-GTAAA-3’ 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGACAACGTACGCATTTACGCGGGACTTTAGCTAA-5’ Caratteristiche degli inneschi Specificità: si ottiene quando una coppia di inneschi (primers) si lega in modo stabile esclusivamente alle sequenze complementari Innesco1: TC Innesco2: AC 5’-AAGTCGCCGTAAATGCGTACTATTGCATGCCTCAATGCGCCCTTAAATGGGTT-3’ CA CA TC TC 3’-TTCAGCGGCATTTACGCATGATAACGTACGGAGTTACGCGGGAATTTACCCAA-5’ PRODOTTO SPECIFICO PRODOTTO ASPECIFICO La dimensione media degli inneschi si aggira intorno ai 20 nucleotidi Composizione delle basi Contenuto in G + C compreso tra 40 e 60% Lunghezza Tra i 18 e 25 nucleotidi Sequenza No sequenze complementari nello stesso primer superiori a 3 basi Complementarietà tra i due inneschi Evitare la formazione di dimeri tra i due primers dovuti a sequenze complementari Estremità degli oligonucleotidi Se possibile l’estremità 3’ deve essere una C o una G Temperatura di fusione (melting temperature) Tm (°C): 2(A + T) + 4(G + C) Valida per primers di 15-20 basi in soluzioni ad alta forza ionica (1 M NaCl) Tm (°C): 81,5 °C + 16,6 (log10[K+]) + 0,41 (%[G+C]) – 675/n n: numero delle basi del nucleotide Valida per primers di 14-70 in soluzioni a concentrazioni cationiche di 0,4 M o meno STAMPO DNA genomico Es: studio di un gene o del promotore DNA genomico virale (diagnosi molecolare) Es: infezione da HPV (Human Papilloma Virus) cDNA DNA complementare cDNA RNA retrotrascrizione Es: profilo di espressione genica Gli altri elementi essenziali Tampone: il più usato è il Tris-HCl che a temperatura ambiente stabilizza il pH della miscela di reazione intorno a 8,3-8,8. Deossiribonucleosidi trifosfato (dNTP): sono i mattoni di cui è costituito il DNA Cationi bivalenti: richiesti dall’enzima per svolgere la propria azione (Mg2+) FASI DELL’AMPLIFICAZIONE VENGONO RIPETUTE CICLICAMENTE APPAIAMENTO DENATURAZIONE ALLUNGAMENTO (ANNEALING) 5’ 3’ APPAIAMENTO DENATURAZIONE ALLUNGAMENTO (ANNEALING) 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ APPAIAMENTO ALLUNGAMENTO DENATURAZIONE (ANNEALING) 5’ 3’ 3’ 5’ 3 FASI DENATURAZIONE ALLUNGAMENTO APPAIMENTO ~ 30 CICLI DENATURAZIONE APPAIAMENTO (ANNEALING) POLIMERIZZAZIONE 94 °C ~ 55 °C 72 °C 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 4 COPIE 2 COPIE 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ STAMPO 3’ 5’ 8 COPIE 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Si parte dall’RNA (totale o mRNA polyA+) RT retrotrascrizione cDNA amplificazione della sequenza di interesse PCR amplicone (prodotto di amplificazione) RETROTRASCRIZIONE Si basa sull’azione delle Trascittasi inverse, cioè di DNA polimerasi RNA-dipendente, polimerasi che usano uno stampo di RNA per produrre una copia di DNA. Le Trascrittasi inverse sono polimerasi che derivano dai retrovirus (virus ad RNA), che le usano per retrotrascivere il loro genoma. Essendo DNA polimerasi hanno bisogno di un innesco per iniziare la sintesi di DNA Nelle reazioni in vitro si usano oligonucleotidi d’innesco sequenza-specifici oppure una collezione di inneschi con sequenza random (casuale). Nel caso di inneschi sequenza-specifici viene retrotrascritto solo l’RNA d’interesse Nel caso della miscela di inneschi random vengono retrotrascritti tutti gli RNA INNESCHI RAMDOM (CASUALI) 2 NUCLEOTIDI A T G C 3 NUCLEOTIDI AA AT AG AC AAA AAT AAG AAC ATA ATG ATC AGA AGT ... TT TA TG TC GG GA GT GC TTT TTA TTG TTC TAT TGT TCT TGG TAC ... CC CA CT CG ... ... In genere si utilizzano oligonucleotidi d’innesco di circa 8 nucleotidi (pdn8) Innesco specifico RNA d’interesse 5’-auucacccaaggcguguucagacuugggccacacguaccccaaauuaaaaaaaaaaa-3’ 3’-tgcatggggttta-5’ Inneschi random Inneschi random Miscela RNA retrotrascrizione PCR con inneschi sequenza-specifici Miscela di cDNA PROFILO TEMPORALE DI ESPRESSIONE GENICA Zebrafish (Danio rerio) BLASTULA → GASTRULA → SOMITOGENESI → PHARYNGULA (inizio) → PHARYNGULA (fine) → LARVA ESTRAZIONE RNA RETROTRASCRIZIONE cDNA PCR con inneschi gene-specifici CORSA ELETTROFORETICA SU GEL DI AGAROSIO Donizetti et al., 2008
![(Microsoft PowerPoint - PCR.ppt [modalit\340 compatibilit\340])](http://s1.studylibit.com/store/data/001402582_1-53c8daabdc15032b8943ee23f0a14a13-300x300.png)
![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
