Le metodiche del DNA ricombinante nella ricerca e diagnostica

LE METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE
NELLA RICERCA E DIAGNOSTICA
MOLECOLARE
DENATURAZIONE TERMICA DEL DNA
PER DENATURAZIONE DEL DNA SI INTENDE
LA PERDITA DELLA SUA STRUTTURA
SECONDARIA CIOE’ LA SEPARAZIONE DELLE
DUE CATENE POLINUCLEOTIDICHE.
LA DENATURAZIONE DEL DNA PUO’ ESSERE
INDOTTA CON UN AUMENTO DELLA
TEMPERATURA.
FIGURA 1.13 GENES VII = 5.2 GENE VI
LA TEMPERATURA ALLA QUALE IL DNA SI
DENATURA DIPENDE DAL CONTENUTO IN GC
ED E’ GENERALMENTE SUPERIORE AGLI
80°C. IN MOLTE APPLICAZIONI DEL DNA
RICOMBINANTE SI OPERA RISCALDANDO IL
DNA A 95 °C. A QUESTA TEMPERATURA I
LEGAMI FOSFODIESTEREI NON SUBISCONO
DANNI E LA STRUTTURA PRIMARIA E’
PRESERVATA.
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
L’ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO E’
UNA METODICA PER LA SEPARAZIONE DI
MOLECOLE DI DNA SOTTO L’INFLUENZA DI
UN CAMPO ELETTRICO
FIGURA 2.11 REECE, ANALISI GENI E GENOMI
L’AGAROSIO
E’ UN
POLISACCARI
DE LINEARE
AL TERMINE DELL’ELETTROFORESI GLI ACIDI
NUCLEICI SONO EVIDENZIATI MEDIANTE
TRATTAMENTO CON BROMURO DI ETIDIO.
IL BROMURO DI ETIDIO E’ UNA MOLECOLA
FLUORESCENTE (SE IRRADIATA CON LUCE
ULTRAVIOLETTA EMETTE LUCE VISIBILE)
CHE SI LEGA AL DNA INTERCALANDOSI TRA
LE BASI AZOTATE.
FIGURA P. 37 GENOMI II
IL GEL SI
OSSERVA AL
BUIO
ESEMPIO DI ANALISI SU GEL DI AGAROSIO
21226 5148 + 4973
4268
3530
2027+1904 1584 1375 947 831 564 -
125 -
CLONAGGIO DEL DNA
CLONARE SIGNIFICA PRODURRE UNA SERIE
DI CLONI, CIOE’ COPIE IDENTICHE DI UNA
MOLECOLA O DI UN ORGANISMO.
CLONARE UNA MOLECOLA DI DNA SIGNIFICA
QUINDI PRODURRE UN ELEVATO NUMERO DI
COPIE DELLA MOLECOLA DI DNA IN ESAME.
CLONAGGIO
IL CLONAGGIO DEL DNA CONSENTE DI
AMPLIFICARE SPECIFICI GENI E DI
ANALIZZARE LA LORO SEQUENZA
NUCLEOTIDICA.
ESISTONO DUE PRINCIPALI STRATEGIE
PER CLONARE UN FRAMMENTO DI DNA:
CLONAGGIO NEI VETTORI PLASMIDICI, CHE
SI REALIZZA CON L’AUSILIO DI CELLULE CHE
ASSISTONO LA DUPLICAZIONE DEL DNA
CLONAGGIO MEDIANTE PCR (REAZIONE A
CATENA DELLA DNA POLIMERASI), CHE SI
REALIZZA IN PROVETTA, IN ASSENZA DI
CELLULE
FIGURA 2.3 GENOMI II: LOCALIZZAZIONE DEL
DNA NELLA CELLULA PROCARIOTICA
TABELLA 8.3 FONDAMENTI DI BIOL. MOL.
FIGURA 5.11 DNA
RICOMBINANTE
IL CLONAGGIO NEI VETTORI SI BASA
SULL’USO DI:
ENZIMI DI RESTRIZIONE
DNA LIGASI
ENZIMI DI RESTRIZIONE
GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE SONO
ENDONUCLEASI DI ORIGINE BATTERICA
CARATTERIZZATE DA UN’ELEVATA
SPECIFICITA’ DI SEQUENZA.
FIGURA 4.4A GENOMI II
CIASCUN ENZIMA DI RESTRIZIONE
RICONOSCE UNA SPECIFICA SEQUENZA
NUCLEOTIDICA E TAGLIA ENTRAMBI I
FILAMENTI DELLA DOPPIA ELICA.
LE ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE
SERVONO AL BATTERIO A DEGRADARE DNA
ESTRANEO, DIFENDENDOSI COSI’
DALL’INFEZIONE DA PARTE DEI FAGI
Un ceppo batterico, per ogni attività di restrizione,
possiede una DNA metilasi che riconosce la
medesima sequenza, la quale viene modificata
aggiungendo gruppi metilici a residui di adenina o
citosina. Di regola, la metilazione blocca il legame
dell’enzima di restrizione, rendendo il DNA
resistente alla scissione.
SONO STATE ISOLATE PIU’ DI 2500
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE E CIRCA
300 SONO COMMERCIALMENTE DISPONIBILI.
PRINCIPALI CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI
DI RESTRIZIONE:
•RICONOSCONO SEQUENZE
PALINDROMICHE, IN MAGGIORANZA DI 6 bp
•TAGLIANO LE DUE CATENE
POLINUCLEOTIDICHE NELLA STESSA
POSIZIONE DI SEQUENZA. SPESSO
GENERANO FRAMMENTI DI DNA CON
ESTREMITA’ SPORGENTI E COESIVE
TABELLA 4.3 GENOMI II
FIGURA 4.10 GENOMI II
DNA LIGASI
FIGURA 4.13 GENOMI II
ENZIMI DI RESTRIZIONE E DNA LIGASI
PERMETTONO DI MANIPOLARE IL DNA IN
VITRO ED OTTENERE MOLECOLE DI DNA
RICOMBINANTE CIOE’ FORMATE DA
SEGMENTI DI DNA DI ORIGINE DIVERSA
FIGURA 4.16 GENOMI II
I VETTORI DI CLONAGGIO PLASMIDICI
TIPICAMENTE CONTENGONO:
•UN’ORIGINE DI REPLICAZIONE
•UN MARCATORE DI SELEZIONE
•UN POLYLINKER
POLYLINKER
ORI
AMP
IL CLONAGGIO DI UN GENE IN PLASMIDI
MODIFICATI, DENOMINATI VETTORI DI
ESPRESSIONE, CONSENTE LA PRODUZIONE
IN BATTERI DI PROTEINE DI INTERESSE
FARMACEUTICO, QUALI L’INSULINA,
L’ERITROPOIETINA E L’ORMONE DELLA
CRESCITA.
UN VETTORE DI ESPRESSIONE E’ UN
VETTORE DI CLONAGGIO MODIFICATO
CONTENENTE UN PROMOTORE ED UN
TERMINATORE DELLA TRASCRIZIONE
LA GENOTECA
L’ISOLAMENTO DI UN GENE DA UNA
DETERMINATA SPECIE ANIMALE O
VEGETALE VIENE EFFETTUATO IN DUE
FASI:
1. CLONAGGIO DI TUTTI I GENI DELLA
SPECIE IN ESAME IN MODO DA OTTENERE
UNA GENOTECA
2. ANALISI DELLA GENOTECA CON UNA
SONDA SPECIFICA PER INDIVIDUARE IL
CLONE CONTENENTE IL GENE DI
INTERESSE
FIGURA 7.6 DNA
RICOMBINANTE
(WATSON) II
EDIZIONE
SEQUENZIAMENTO DEL DNA
IL METODO DI SEQUENZIAMENTO PIU’
UTILIZZATO E’ QUELLO DI SANGER, BASATO
SULL’USO DI DIDEOSSINUCLEOTIDI.
IL DNA DA SEQUENZIARE VIENE RICOPIATO
IN PRESENZA DI DIDEOSSINUCLEOTIDI 5’TRIFOSFATO CHE AGISCONO COME
TERMINATORI DELLA POLIMERIZZAZIONE
SEGNALANDO LA POSIZIONE DELLE
SINGOLE BASI.
FIGURA 6.2 GENOMI II
PREPARAZIONE DI UN cDNA
LE MOLECOLE DI RNA NON POSSONO
ESSERE CLONATE. SE SI VUOLE STUDIARE
UNO SPECIFICO RNA MESSAGGERO
OCCORRE PRIMA CONVERTIRLO IN cDNA.
UN cDNA E’ UN DNA COMPLEMENTARE AD
UN RNA MESSAGGERO, OTTENUTO IN VITRO
UTILIZZANDO UNA TRASCRITTASI INVERSA
RETROVIRALE.
mRNA
TRASCRIZIONE
INVERSA
cDNA
ESSENDO OTTENUTO DA UN MRNA CHE HA
GIA’ SUBITO IL PROCESSO DI SPLICING, IL
cDNA RISULTA PRIVO DI INTRONI. LO
STUDIO DI UN cDNA RISULTA QUINDI PIU’
SEMPLICE DELLO STUDIO DEL RELATIVO
GENE.
REAZIONE A CATENA DELLA DNA
POLIMERASI
LA REAZIONE A CATENA DELLA DNA
POLIMERASI O POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR) CONSENTE DI CLONARE IL
DNA IN PROVETTA, RIPRODUCENDO LE
CONDIZIONI UTILI ALLA REPLICAZIONE DEL
DNA
PCR
FIGURA 13.11 GENOMI II
I CICLI TERMICI DELLA PCR
Denaturazione
(1min a 94°C)
Extension o
polimerizzazione
(1min a 72°C)
Annealing o
ibridazione (1min
a circa 50°C)
FIGURA 4.30 GENOMI II
CONFRONTO TRA LE DUE STRATEGIE DI
CLONAGGIO
CLONAGGIO IN UN
VETTORE PLASMIDICO
CLONAGGIO MEDIANTE
PCR
PREGI DELLA PCR:
•ELEVATA VELOCITA’ DI ESECUZIONE
•ELEVATA SENSIBILITA’
PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR:
•ISOLAMENTO DI GENI
•DIAGNOSI DI MALATTIE INFETTIVE
•DIAGNOSI MALATTIE GENETICHE
•TIPIZZAZIONE DEL DNA (DNA
FINGERPRINTING) PER ANALISI MEDICOLEGALI
FIGURA 4.3 GENOMI II
GLI OLIGO SERVONO DA
SONDE
TABELLA 27.6 DNA RICOMBINANTE
LA TIPIZZAZIONE DEL DNA CONSENTE DI
DETERMINARE IL PROFILO GENETICO DI UN
INDIVIDUO. TALE ANALISI E’ UTILE IN VARI
CAMPI DELLA MEDICINA LEGALE, AD
ESEMPIO PER:
•ANALISI DI PATERNITA’
•RICONOSCIMENTO RESTI CORPOREI
•TRACCIARE IL PROFILO GENETICO
DELL’AUTORE DI UN CRIMINE
IL TERMINE CLONAZIONE HA ALMENO TRE
SIGNIFICATI. SI PUO’ CLONARE UN GENE
(FARNE NUMEROSE COPIE), CLONARE UNA
CELLULA (FARLA RIPRODURRE
ASESSUALMENTE) O CLONARE UN
ORGANISMO PLURICELLULARE. CLONARE
SPECIE VEGETALI E’ PIUTTOSTO FACILE.
CLONARE ANIMALI ED IN PARTICOLARE
MAMMIFERI E’ MOLTO DIFFICILE. LA
PECORA DOLLY E’ STATA IL PRIMO
MAMMIFERO AD ESSERE CLONATO.
LA PECORA DOLLY E’
STATA OTTENUTA
TRAPIANTANDO IL
NUCLEO DIPLOIDE DI UNA
CELLULA SOMATICA
DELLA MADRE GENETICA
IN UNA CELLULA UOVO
ANUCLEATA
PROVENIENTE DA UNA
DONATRICE