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Capitolo 12
La tecnologia del DNA
e la genomica
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La tecnologia del DNA ricombinante
12.1 Mediante l’introduzione dei plasmidi si possono
modificare i batteri e indurli a svolgere funzioni utili
• La maggior parte dei metodi utilizzati per studiare e
manipolare il DNA utilizza i batteri e in particolare
Escherichia coli.
• Per manipolare i geni in laboratorio i biologi usano
spesso i plasmidi batterici, che possono portare a
duplicare all’interno di un batterio qualsiasi gene.
• I plasmidi sono gli strumenti chiave della
clonazione genica, ossia la produzione di molte
copie identiche di tratti di DNA.
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• I ricercatori possono inserire in un plasmide un
pezzo di DNA contenente un gene dando origine a
DNA ricombinante.
• Il plasmide viene poi introdotto nella cellula
batterica.
• Il batterio geneticamente modificato è messo in
coltura e si riproduce per formare un clone di
cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula
madre da cui derivano).
• Ogni cellula possiede una copia del gene.
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Batterio
1
Si isola un plasmide
2
3
Cromosoma Plasmide
batterico
DNA
ricombinante
(plasmide)
Si inserisce
un gene nel
plasmide
Si isola
il DNA
Gene prescelto
4
Batterio
ricombinante
5
Copie
di geni
2
Cellula contenente il
gene prescelto
DNA
Si introduce il plasmide nella
cellula prescelta
Si clona la cellula che possiede il
gene prescelto
Copie
di proteine
Clone della
La proteina consente
Il gene per la
cellula
alla neve
resistenza
di formarsi anche a
alle malattie
temperature maggiori
è inserito
nelle piante
Il gene modifica i batteri e li rende La proteina viene usata per sciogliere
in grado di eliminare i rifiuti tossici i coaguli nella terapia contro gli infarti
Figura 12.1
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12.2 Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano
particolari enzimi
Gli strumenti per ottenere DNA ricombinante sono:
• enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che
riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e
le tagliano in punti precisi;
• l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei
filamenti di DNA catalizzando la formazione di legami
covalenti.
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Produzione di DNA
ricombinante tramite l’uso
di enzimi di restrizione e
dell’enzima DNA-ligasi:
L’enzima di restrizione riconosce la sequenza
1
DNA
GAATTC
CTTAAG
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
Aggiunta di un frammento di
DNA di provenienza estranea
3
Due frammenti si attaccano tra
loro appaiando le basi azotate
4
G A AT T C
C T TA A G
G A AT T C
C T TA A G
L’enzima DNA-ligasi
incolla i frammenti
5
Figura 12.2
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DNA ricombinante
12.3 I geni dei plasmidi ricombinanti si possono
clonare
• I plasmidi entrano nei batteri per trasformazione.
• I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono messi in
condizione di riprodursi, dando origine a un clone
di cellule con molte copie dei plasmidi e dei geni
che trasportano.
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Clonazione di un
gene in un
plasmide batterico:
1 Si isola il DNA da due fonti diverse
2 Si tagliano
entrambi i DNA
con un enzima di
restrizione
E.coli
Cellula umana
Plasmide
DNA
Gene V
Estremità coesive
3 Si mescolano le molecole di DNA che si
uniscono mediante
appaiamento di basi azotate
4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con
legami covalenti
Plasmide con
DNA ricombinante
Gene V
5 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite
trasformazione
Batterio
ricombinante
6 Si clona il batterio
Figura 12.3
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Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
12.4 Per ottenere molte copie di una specifica
sequenza di DNA si utilizza comunemente la tecnica
PCR
Quando il campione di DNA è
scarso o impuro, la reazione a
catena della polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, o
PCR) è un metodo più
appropriato per ottenere un
grande quantitativo
di un particolare gene.
Molecola
iniziale
di DNA
1
Figura 12.4
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2
4
8
Numero di molecole di DNA
12.5 I geni clonati possono essere conservati in
«librerie» genomiche
L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun,
derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una
cellula, è chiamata libreria genomica.
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione
Plasmide
ricombinante
DNA fagico
ricombinante
oppure
Clone
batterico
Figura 12.5
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Libreria plasmidica
Clone
fagico
Libreria fagica
12.6 Si può produrre DNA da clonare anche
mediante l’enzima trascrittasi inversa
L’enzima trascrittasi
inversa può essere usato
per ottenere librerie di DNA
complementare (cDNA)
contenenti solo i geni
espressi da un particolare
tipo di cellula.
Figura 12.6
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12.7 Cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati
per ottenere prodotti genici su larga scala
• Le applicazioni della clonazione genica includono
la produzione di prodotti genici su larga scala per
usi medici e altri usi.
• I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi
migliori per sintetizzare un prodotto proteico.
• Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le
cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.
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COLLEGAMENTI
12.8 La tecnologia del DNA sta cambiando l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
• La tecnologia del DNA ha avuto un enorme impatto
sull’industria farmaceutica e sulla medicina umana.
• Le sue tecniche sono ampiamente utilizzate per
produrre farmaci e per la diagnosi delle malattie.
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Terapie ormonali
• L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati
i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della
tecnologia del DNA ricombinante.
• Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i
tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.
Figura 12.8A
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Diagnosi e cura delle malattie
• In campo medico la tecnologia del DNA sarà,
probabilmente, sempre più usata per diagnosticare
le malattie.
• Oltre alla sua evidente importanza
nell’identificazione degli alleli associati alle malattie
genetiche, si rivela infatti utile nel localizzare le
infezioni.
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Vaccini
• Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in
grado si sintetizzare anche nuovi vaccini.
• Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di
un agente patogeno (di solito un batterio o un virus)
ed è utilizzato per prevenire una malattia infettiva.
Figura 12.8B
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L’analisi dei frammenti di restrizione e le
impronte genetiche
12.9 Le sonde molecolari identificano i cloni che
portano determinanti geni
•
La tecnologia del DNA può essere usata per
identificare specifici frammenti di DNA.
•
I metodi utilizzati per individuare direttamente un
gene si basano tutti sull’accoppiamento tra le basi
azotate del gene in questione e quelle di una
sequenza complementare appartenente a un’altra
molecola di acido nucleico (DNA o RNA).
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• Per trovare una specifica sequenza nucleotidica
all’interno di un certo quantitativo di DNA si usa
una molecola chiamata sonda.
• Le sonde di acidi nucleici sono brevi filamenti
singoli di DNA o RNA marcati radioattivamente o
fluorescente che possono legarsi a un determinato
gene in una libreria.
Sonda radioattiva
(DNA)
La sonda viene mescolata
col DNA a filamento singolo
prelevato da vari cloni batterici o fagici
DNA a filamento singolo
Figura 12.9
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Mediante l’appaiamento
delle basi azotate
si individua il gene prescelto
12.10 I microarray a DNA forniscono
contemporaneamente informazioni sull’espressione
di molti geni
• Per effettuare analisi su larga scala, per
determinare quali geni sono attivi in una particolare
cellula in un dato momento, si può usare la tecnica
che impiega i microarray a DNA.
• Il microarray a DNA è un vetrino rettangolare, non
più grande dell’impronta di un pollice, contenente
uno strato di molecole a filamento singolo di DNA,
che portano migliaia di geni noti e diversi.
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Un microarray a DNA:
Microarray a DNA
Dimensioni effettive
(6400 geni)
Ogni pozzetto contiene
il DNA di un gene particolare
1 L’mRNA
viene isolato
Mediante la trascrittasi inversa
si ottengono tratti di DNA
fluorescenti
2 Dall’mRNA
viene ottenuto
cDNA
4 Il cDNA non
legato viene
allontanato
3 Il cDNA viene
applicato
ai pozzetti
Figura 12.10
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Punto fluorescente
Punto non fluorescente
cDNA
DNA di un gene
espresso
DNA di un gene
non espresso
12.11 L’elettroforesi su gel separa i frammenti di
DNA in base alle loro dimensioni
Miscela di molecole
di DNA di dimensioni
diverse
-
+
Molecole
più lunghe
Generatore
elettrico
Gel
+
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Molecole
più corte
+
Figura 12.11
Disposizione finale
12.12 Il polimorfismo della lunghezza dei frammenti
di restrizione permette di individuare le differenze tra
sequenze di DNA
• I marcatori genetici comprendono geni, siti di
restrizione e tratti di DNA non codificante.
• L’analisi dei frammenti di restrizione è un metodo
per individuare le differenze nelle sequenze
nucleotidiche tra campioni omologhi di DNA.
• Il numero dei frammenti di restrizione e la loro
lunghezza riflettono la sequenza specifica di
nucleotidi nel DNA di partenza.
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In che modo i frammenti di restrizione riflettono la
sequenza del DNA
Le differenze tra i frammenti di restrizione che vengono
prodotte sono dette poliformismi della lunghezza dei
frammenti di restrizione
Allele I
Allele II
(Restriction Fragment Length
(scena del crimine)
(indiziato)
Polymorphisms o RFLP) e
w
riflettono le differenze nelle
Taglio
sequenze del DNA di partenza.
C
C
G
G
G
G
C
C
z
A
C
G
G
T
G
C
C
x
Taglio
y
Figura 12.12A
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C
C
G
G
G
G
C
C
Taglio C G
y
C G
G C
G C
DNA prelevato dai cromosomi
Dopo il taglio con gli enzimi di restrizione, i frammenti
vengono separati su un gel:
1
–
2
Frammenti
più lunghi
z
x
w
Frammenti
più corti
Figura 12.12B
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+
y
y
Per individuare gli alleli difettosi si possono usare le
sonde a DNA
• Un’importante applicazione dell’analisi dei
frammenti di restrizione consiste nell’individuare
alleli con alterazioni correlabili a patologie
genetiche non manifeste.
• Le sonde radioattive possono rivelare bande di
DNA d’interesse su un gel.
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Utilizzo dell’analisi dei frammenti di restrizione per
individuare un allele dannoso:
1
Preparazione dei
frammenti di restrizione
I
II
III
Frammenti
di restrizione
2
Elettroforesi su gel
3
Assorbimento
4
Sonda radioattiva
I II III
Carta da filtro
Filamento singolo
di DNA radioattivo (sonda)
Sonda
5
Rilevamento della
radioattività
(autoradiografia)
I
II
III
Pellicola
Figura 12.12C
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I
II
III
COLLEGAMENTI
12.13 Impieghi della tecnologia del DNA in campo
legale
• La tecnologia del DNA viene ampiamente utilizzata
in medicina legale per analizzare le prove rinvenute
sulla scena di un crimine.
• Il test del DNA può consentire di individuare il
responsabile con una certa sicurezza poiché la
sequenza di basi azotate del DNA di ogni persona
è unica (tranne nel caso dei gemelli identici).
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Un’impronta genetica (DNA fingerprint) può aiutare a
risolvere in crimine:
Sangue
dell’imputato
Sangue rinvenuto
sui vestiti dell’imputato
Figura 12.13A
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Sangue
della vittima
Figura 12.13B
COLLEGAMENTI
12.14 Un giorno la terapia genica potrebbe fornire la
cura per molte malattie
La terapia genica può correggere le malattie imputabili
a un singolo gene difettoso, sostituendolo o integrandolo
con un allele normale.
Gene clonato
(allele normale) 1 Inserimento del gene normale nel virus
Acido nucleico virale
Retrovirus
2 Le cellule del midollo osseo vengono infettate con il virus
3 Il DNA virale si inserisce nei cromosomi
Cellule di midollo osseo del paziente
Midollo osseo
Figura 12.14
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4 Le cellule
vengono iniettate nel paziente
• La terapia genica potrebbe un giorno essere usata
per curare sia le malattie genetiche, sia le malattie
non genetiche.
• Anche se è uno strumento molto promettente,
esistono ancora poche prove scientifiche evidenti
della sua efficacia.
• La ricerca continua seguendo linee guida nuove e
più sicure.
• La terapia genica sull’uomo solleva problemi sia
tecnici sia etici.
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La genomica e gli OGM
12.15 Il Progetto Genoma Umano
• Lo scopo primario del Progetto Genoma Umano
(PGU) è mappare l’intero genoma dell’uomo e
determinare la sequenza nucleotidica completa del
DNA umano.
• Iniziato nel 1990, è oggi largamente completato:
nel 2001 sono stati pubblicati i risultati del
sequenziamento di oltre il 90% del genoma umano.
Figura 12.15
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• I dati ottenuti stanno fornendo informazioni su
sviluppo, evoluzione e molte malattie.
• I benefici che possono derivare dalla conoscenza
del genoma umano riguardano essenzialmente la
ricerca di base.
• L’enorme numero di dati raccolti è depositati in un
archivio accessibile in rete ai ricercatori di tutto il
mondo.
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12.16 La maggior parte del genoma umano non è
costituito da geni
• Il genoma umano comprende circa 35 000 geni che
codificano per varie proteine, nonché per i tRNA e
gli rRNA.
• Oltre a questi geni, come quello della maggior
parte degli eucarioti complessi, il genoma umano
include un’enorme quantità di DNA non codificante
(circa il 97% del totale).
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• Nella porzione di DNA non codificante sono
comprese le sequenze regolatrici, come i promotori
e gli enhancer.
• Il restante DNA, che comprende gli introni, e il DNA
non codificante localizzato tra i geni, è stato
chiamato junk DNA, ossia «DNA spazzatura».
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12.17 Grazie alla scienza della genomica sono stati
sequenziati interni genomi
• Oltre a mappare il DNA umano, ricercatori di tutto il
mondo stanno lavorando anche sui genomi di altre
specie.
• Alcuni genomi sono stati completamente
sequenziati.
• La maggior parte dei genomi in corso di studio
riguarda i procarioti, il gruppo include però anche
una ventina di specie eucariotiche (tra cui
vertebrati, invertebrati e piante).
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Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile
in particolare ai fini dell’analisi comparativa con il
genoma umano, che gli scienziati stanno tentando di
interpretare.
Figure 12.17A, B
Tabella 12.17
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• La proteomica è lo studio sistematico degli insiemi
completi di proteine (proteomi) codificati dai
genomi.
• Il numero delle proteine presenti negli organismi
umani supera di gran lunga quello dei geni.
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COLLEGAMENTI
12.18 Gli organismi geneticamente modificati stanno
trasformando l’agricoltura
• Gli scienziati che si occupano del fabbisogno
alimentare mondiale hanno cominciato a usare la
tecnologia del DNA per produrre organismi
geneticamente modificati (OGM), piante e
animali, da utilizzare in agricoltura.
• Un organismo geneticamente modificato è un
organismo ottenuto grazie alla modificazione o
all’aggiunta di uno o più geni.
• Un OGM si può ottenere anche con i normali
metodi di incrocio.
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Utilizzo del plasmide Ti (un plasmide che proviene dal
batterio del suolo Agrobacterium tumefaciens) come
vettore per modificare geneticamente le piante:
Agrobacterium tumefaciens
DNA contenente il gene prescelto
1
Plasmide
Ti
T DNA
Inserimento del
gene di un plasmide
mediante l’enzima
di restrizione e la
DNA-ligasi
Plasmide Ti
ricombinante
Cellula vegetale
2
Inserimento
in cellule
vegetali
in coltura
Crescita
della pianta
Il T DNA inserito
porta il nuovo gene
Sito di restrizione
Figura 12.18A
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3
Pianta con
caratteristiche nuove
• I genetisti molecolari sono in grado di produrre
animali transgenici che hanno, inseriti nel proprio
genoma, geni provenienti da altri organismi.
• Anche molte colture e piante sono geneticamente
modificate.
Figura 12.18B
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COLLEGAMENTI
12.19 Gli organismi GM possono danneggiare
l’ambiente o la salute umana?
Lo sviluppo di organismi GM richiede severe misure di
sicurezza.
Figura 12.19A
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• Gli organismi GM possono rappresentare un rischio
per l’ambiente o la salute.
• Il maggior pericolo per l’ambiente potrebbe essere
rappresentato dal trasferimento di geni modificati dalle
colture GM alle colture vicine.
Figura 12.19B
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