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LA BIOLOGIA MOLECOLARE
DEL GENE
• Un enzima è una molecola proteica che si
comporta come catalizzatore biologico
• Essi hanno la funzione di velocizzare la
maggior parte delle reazioni chimiche che
avvengono in un organismo
• Si ritrovano immutati al termine della
reazione
•Perchè una reazione chimica inizi, i reagenti devono
assorbire una quantità di energia chiamata energia di
attivazione (EA).
Enzima
Barriera EA
Reagenti
Figura 5.5A
Contenitore 1
Prodotti
Contenitore 2
– Un enzima si LEGA AI REAGENTI per abbassare
l’energia di attivazione necessaria per avviare una
reazione chimica.
EA senza
enzima
EA con
enzima
Energia
Reagenti
Differenza
netta
di energia
Prodotti
Figura 5.5B
Direzione della reazione
• Ogni cellula contiene molti enzimi
• Ogni reazione cellulare è catalizzata da un
enzima specifico
• Gli enzimi hanno strutture tridimensionali
caratteristiche che determinano le reazioni
chimiche che essi sono in grado di catalizzare
in una cellula
L’azione catalitica di un enzima consiste in un ciclo a
quattro fasi che si ripete migliaia di volte in tempi
brevissimi
1.
Il substato- sito attivo del reagente si combina
specificatamentecon la molecola dell’enzima
_MECCANISMO CHIAVE-SERRATURA_
2.
la combinazione con l’enzima attiva il substrato
rendendo più reattivi alcuni legami più reattivi
3.
Il substrato viene trasformato in prodotto
4.
I prodotti si dissociano dall’enzima che può
nuovamente andare incontro alla fase1
•Esempio di reazione catalizzata da un enzima:
1 Enzima disponibile
con il sito attivo
vuoto
Sito attivo
Glucosio
Substrato
(saccarosio)
Il substrato
2 si lega all’enzima
che subisce
un adattamento indotto
Enzima
(saccarasi)
Fruttosio
H2O
4 I prodotti
vengono liberati
3 Il substrato
si scinde
nei prodotti
L’AMBIENTE CELLULARE INFLUENZA L’ATTIVITÀ DEGLI ENZIMI
– La temperatura, la concentrazione dei sali e il pH
influenzano l’attività enzimatica.
– Per funzionare, alcuni enzimi richiedono molecole non
proteiche chiamate cofattori.
– I cofattori possono essere sostanze inorganiche, come
gli ioni metallo, o molecole organiche (in questo caso si
chiamano coenzimi).
– Una sostanza chimica che interferisce con
l’attività di un enzima è detta inibitore.
– L’azione di un inibitore è irreversibile se si
formano legami covalenti tra inibitore ed
enzima. È reversibile quando si formano solo
legami deboli (come il legame idrogeno).
– Gli inibitori competitivi occupano il sito attivo di
un substrato.
– Gli inibitori non competitivi cambiano la funzione
dell’enzima modificando la sua forma.
Substrato
Sito attivo
Enzima
Legame normale del substrato
Inibitore
competitivo
Inibitore
non competitivo
Inibitore enzimatico
GENETICA
FENOTIPO: l’aspetto fisico e fisiologico di una cellula
GENOTIPO : insieme di tutti i geni di una cellula
IL FENOTIPO
è il risultato dell’espressione del
GENOTIPO
CONCLUSIONI GENETICA CLASSICA
I CROMOSOMI SONO PORTATORI DELL’ EREDITARIETA’
I GENI SI TROVANO SUI CROMOSOMI STRUTTURE
PRESENTI NEL NUCLEO DELLE CELLULE EUCARIOTE
GENETICA MOLECOLARE INDAGA
• COMPOSIZIONE CHIMICA
• STRUTTURA
• PROPRIETA’
• FUNZIONAMENTO DEI GENI
•
Ogni cromosoma è composto da una lunga
molecola di DNA associata a proteine
• Alcuni esperimenti hanno dimostrato che il
materiale genetico è formato da DNA
• le proteine dei cromosomi hanno funzione
strutturale
•Il DNA è un acido nucleico costituito da lunghe
catene di nucleotidi.
Scheletro zucchero-fosfato
A
C
Gruppo fosfato
Base azotata
Zucchero
Nucleotide
del DNA
A
C
Base azotata
(A, G, C, o T)
Gruppo
fosfato
O
H3C
C
O
T
T
O
P O
G
T
CH
HC
H C
CH
H
Zucchero
(deossiribosio)
Nucleotide del DNA
Polinucleotide
del DNA
H
Timina (T)
O
O
T
N
CH2 H C N C O
O–
G
C
•Il DNA ha quattro tipi di basi azotate:
•adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G)
H
O
H3C
H
C
C
C
H
H
N
C
H
N
C
N
C
C
C
N
H
O
N
H
H
Timina (T)
Citosina (C)
Pirimidine
H
N
H
O
N
H
O
C
C
N
C
C
N
H
C
N
N
H
N
C
C
N
H
Adenina (A)
Guanina (G)
Purine
H
C
N
H
C
C
N
H
H
•Anche l’RNA è un acido nucleico ma è
composto da uno zucchero leggermente
differente (il ribosio) e una base azotata
chiamata uracile (U) al posto della timina.
Base azotata
(A, G, C, o U)
O
Gruppo
fosfato
H
C
N
C
H
O
Ossigeno
C
O
P
Legenda
Idrogeno
Carbonio
Azoto
O
H
CH2
C
N
O
Uracile (U)
O–
O
C H
H C
H C
C H
O
OH
Zucchero
(ribosio)
Fosforo
Nel 1953 James Watson e Francis Crick determinarono
la struttura tridimensionale del DNA, basandosi anche
sul lavoro di Rosalind Franklin.
– La struttura del DNA consiste di due filamenti di
polinucleotidi attorcigliati l’uno sull’altro in una
doppia elica.
– Si può immaginare questa struttura come una
scala di corda dotata di rigidi pioli in legno e
arrotolata in spire.
Torsione
– I legami idrogeno tra le basi tengono uniti i
filamenti.
– Ogni base è appaiata con una base
complementare: A con T, e G con C
catene complementari
G
C
T
A
A
Coppie di basi
appaiate
C
T
C
G
C
G
A
T
T
O
O
P
–O
O
H2C
O
O
P
–O
O
H2C
G
T
O
OH
P
O
O
H2C
–O
A
O
O
–O P
O
H2C
A
A
T
A
Legame idrogeno
OH
O
O
O
A
T
CH2
O O–
P
O
O
O
CH2
O O–
O P
O
O
CH2
O
O–
P
O
O
O
CH2
O
O–
P
HO O
C
G
G
C
A
T
T
OH
G
A
O
C
T
Modello a nastro
Struttura chimica
Modello computerizzato
CONOSCENDO LA CONFORMAZIONE SPAZIALE DELLA
MOLECOLA SI INIZIA AD INTUIRE COME POSSA:
IMMAGAZZINARE
COPIARE
TRASMETTERE L’INFORMAZIONE GENETICA
DUPLICAZIONE
UTILIZZARE QUESTE INFORMAZIONI PER DIRIGERE LA SINTESI PROTEICA
SINTESI PROTEICA
– Esempio di divisione
Cromosoma
cellulare
procariotico
Membrana
plasmatica
Parete
1
Il cromosoma si duplica e le
due copie si separano
2
La cellula continua ad allungarsi;
i cromosomi si spostano
3 La cellula si divide
in due cellule figlie
– Cellula batterica
MODELLO SEMICONSERVATIVO
• I due filamenti di DNA di
partenza si separano e
ciascuno di essi funziona
da stampo per formare il
filamento complementare.
I nucleotidi si allineano uno
alla volta lungo il filamento
stampo secondo la regola
dell’appaiamento delle
basi azotate
La duplicazione del DNA inizia presso specifici punti di
origine della duplicazione sulla doppia elica.
Punto di origine
della duplicazione
Filamento originario
Filamento di nuova sintesi
Bolla di duplicazione
Due molecole figlie di DNA
•Ogni filamento di una doppia elica ha un
orientamento opposto all’altro.
Estremità 5
P
Estremità 3
HO
5
4
3
2
2
1
A
T 1
5
P
P
C
G
P
P
G
C
P
P
T
OH
Estremità 3
3
4
A
P
Estremità 5
– La cellula sintetizza un filamento nuovo in maniera
continua usando l’enzima DNA-polimerasi.
– L’altro filamento è sintetizzato in brevi segmenti
consecutivi che sono poi uniti in un unico filamento
dall’enzima DNA-ligasi.
Molecola di DNA-polimerasi
5
3
DNA originario
3
5
Filamento sintetizzato
senza interruzioni
3
5
5
3
DNA-ligasi
Direzione complessiva della duplicazione
Filamento sintetizzato
in segmenti
consecutivi
PCR
• La reazione a catena della
polimerasi (in inglese:
Polymerase Chain Reaction),
comunemente nota con
l'acronimo PCR, è una tecnica
di biologia molecolare che
consente la moltiplicazione
(amplificazione) di frammenti
di acidi nucleici dei quali si
conoscano le sequenze
nucleotidiche iniziali e terminali.
L'amplificazione mediante PCR
consente di ottenere in vitro
molto rapidamente la quantità
di materiale genetico
necessaria per le successive
applicazioni
Quando il campione di DNA è
scarso o impuro, la reazione a
catena della polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, o
PCR) è un metodo più
appropriato per ottenere un
grande quantitativo
di un particolare gene.
Molecola
iniziale
di DNA
1
2
4
8
Numero di molecole di DNA
• La PCR ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della riproduzione
cellulare: la ricostituzione (sintesi) di un segmento di DNA "completo"
(a doppia elica) a partire da un filamento a singola elica. Il filamento
mancante viene ricostruito a partire da una serie di nucleotidi (i
"mattoni" elementari che costituiscono gli acidi nucleici) che
vengono disposti nella corretta sequenza, complementare a quella
del DNA interessato.
• Questo processo viene svolto in natura da enzimi chiamati DNApolimerasi, che sono in grado di sintetizzare progressivamente un
nuovo filamento di DNA nelle seguenti condizioni:
• devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di
desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP);
• il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che
compongono i filamenti devono essere già separate;
• il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato, ovvero non
è possibile sintetizzare un nuovo filamento a partire da zero;
• devono inoltre essere rispettate opportune condizioni di
temperatura, pH, ecc.
• È possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla
formazione dei nuovi segmenti di DNA, ponendo in soluzione:
• una quantità, anche minima, del segmento di DNA che si
desidera riprodurre;
• una quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire i
nuovi filamenti;
• opportuni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi sequenze
di DNA (oligonucleotidi) complementari agli estremi 5’ e 3’ del
segmento da riprodurre;
• altri elementi di supporto (ad es. ioni magnesio), necessari per
costituire l'ambiente adatto alla reazione;
• una DNA polimerasi (non è necessario che provenga dallo
stesso organismo di cui si deve replicare il DNA).
• Per avviare la reazione della polimerasi (fase di
prolungamento del filamento a partire dal primer 5’) è prima
necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA
(fase di denaturazione), quindi alla creazione del legame tra i
primer e le regioni loro complementari dei filamenti di DNA
denaturati (fase di annealing). Questo processo risulta però
incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene
distrutta alle temperature necessarie alla denaturazione (9699 °C).
• Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alle polimerasi
appartenenti a organismi termofili che non sono inattivate
dalle alte temperature, ad esempio la Taq polimerasi
proveniente dal batterio termofilo Thermus aquaticus. Ciò
consente di realizzare più cicli di PCR in sequenza, in ciascuno
dei quali viene duplicato anche il DNA sintetizzato nelle fasi
precedenti, ottenendo una reazione a catena che consente
una moltiplicazione estremamente rapida del materiale
genetico di interesse.
•
Schema di un ciclo di PCR [La soluzione di DNA da
replicare, desossiribonucleotidi trifosfati, ioni
magnesio, primer e DNA polimerasi viene portata a
una temperatura compresa tra 94 e 99 °C. Ci si
trova, di conseguenza, in una situazione in cui la
doppia elica del DNA viene completamente scissa
ed i due filamenti di cui essa è composta sono liberi
(fase di denaturazione).
•
Successivamente la temperatura viene abbassata
fino a 40-55 °C circa al fine di permettere il legame
dei primer alle regioni loro complementari dei
filamenti di DNA denaturati (fase di annealing).
•
Infine la temperatura viene alzata fino a 65-72 °C al
fine di massimizzare l'azione della DNA polimerasi
che determina un allungamento dei primer legati,
utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA
(fase di prolungamento).
•
Il ciclo descritto viene ripetuto generalmente per
circa 30-40 volte. In genere non si superano i 50 cicli
in quanto ad un certo punto la quota di DNA
ottenuto raggiunge un plateau. Ciò avviene, ad
esempio, per carenza degli oligonucleotidi usati
come inneschi o per diminuzione dei dNTP. Bisogna
inoltre considerare che si potrebbe amplificare in
maniera eccessiva anche eventuale materiale
genomico contaminante.