Registro Toscano Difetti Congeniti VI Corso Residenziale Cortona, 29-30 nov.2007 OSTEOGENESI IMPERFETTA Monica Mottes Dip. Materno Infantile e di Biologia e Genetica Università di Verona [email protected] 1 O.I. aspetti molecolari • Nella maggioranza dei casi (≤ 90%) è imputabile a mutazioni ad effetto dominante in uno dei due geni, COL1A1 e COL1A2, codificanti per il collagene I. • Molte sono le mutazioni “de novo” casi sporadici • Nella forma lieve (OI I) spesso casi familiari • Mosaicismo germinale in genitori sani può causare ricorrenza (5-7%) • Mutation database (>>1000 mut): www.le.ac.uk/genetics/collagen/index.html 3 I geni del collagene I: 52 esoni di piccole dimensioni “standard” (45,54, 99, 108 bp) 4 Motivo a tripla elica 5 OI: correlazioni genotipo-fenotipo difetto qualitativo OI tipo IV, III, II (p.es. sostituzione Gly in COL1A1 O COL1A2) difetto quantitativo (allele COL1A1 silente) mod, sev, letale OI tipo I lieve 6 OI: correlazioni genotipo genotipo per sostituzioni di glicina COL1A1 COL1A2 NL L > mutazioni L in COL1A1, effetto piu’ grave sost. G-Ser sono le piu’ frequenti in entrambi i geni e spesso NL P I (dati da : OI consortium, Hum Mutat 2007, 28:209) 7 1.Ereditarietà dell’O.I. Autosomica dominante sporadica familiare ricorrente (mosaicismo germinale) 8 2.Ereditarietà dell’O.I. Autosomica recessiva (c.ca 5% dei casi di OI) • Recentemente (2006-2007) identificati due nuovi loci malattia, causa di OI severa/letale con eredità AR 9 OI: correlazioni genotipo fenotipo • Qualche caso esemplare dalla nostra esperienza di diagnostica molecolare -G.Venturi, M. Corradi Sez. Pediatria DMIBG & Azienda Ospedaliera, Verona - M.Valli Dip. Biochimica, Pavia - JC Marini NIH Bethesda 10 OI : diagnostica molecolare • Sequenziamento diretto DNA genomico COL1A1 e COL1A2 esoni + splicing junctions • Quando disponibile biopsia: • anche analisi dei trascritti (p.es. per mutazioni di splicing) e analisi biochimica: valutazione delle catene collageniche • La ricerca della mutazione causale ha tempi lunghi • La DP è possibile solo per mutazioni già caratterizzate in famiglia 11 OI I-caso familiare Mottes et al., J Med Genet 1990; 27:367 1. Analisi di linkage con polimorfismi intragenici: locus concordante è COL1A1 12 OI I-caso familiare 2. Analisi biochimica: catene collageniche hanno mobilità normale 3. Test “allele nullo: un allele COL1A1 non produce mRNA stabile g-DNA a1(I) a2(I) C P mRNA 13 OI I –caso familiare • 4. Mutazione causale (in eterozigosi): Gene COL1A1 Esone 41 g.12698 C>T CAG (Gln)TAG (Stop) N.B. mRNA contenenti codoni di terminazione prematura vanno incontro a degradazione Nonsense Mediated Decay (NMD) 14 OI severa (II/III)-caso sporadico ♀ deceduta all’età di 18 m per problemi respiratori * * medium cell layer Analisi biochimica: catene a1(I) anomale * 15 OI severa (II/III)-caso sporadico • Mutazione: gene COL1A1 esone 46 G>C (g.13924 AF017178) GGA(gly910)GCA (ala) •La mutazione abolisce un sito MspI: Allele normale=279 bp Allele mutato= 315 bp N OI P 16 OI letale ricorrente 1. Analisi biochimica: migrazione anomala * catene a1(I) minore secrezione procollagene I * 17 OI letale ricorrente 1: mosaicismo parentale • Mutazione: gene COL1A1 esone G>A(g.8867 AF017178) GGC(gly415)AGC(ser) (abolisce un sito MspI) * • presente in eterozigosi nel feto affetto, in quota variabile nel padre: 26-29% spermatozoi ASO RFLP * 18 OI letale ricorrente 2 m c.l. * * Analisi biochimica: migrazione anomala * catene a1(I) 19 OI letale ricorrente 2. • Sequenziamento completo (esoni + splicing junctions) dei geni COL1A1 e COL1A2 esito negativo 20 Nuovi loci malattia per OI: Morello et al., Cell 127, 291-304, 2006 Cabral et al., Nature genet. 39,359-365, 2007 21 Biosintesi del collagene 22 Nuovi loci per OI LEPRE 1 (1p34) prolyl3-idrossilasi 1 CRTAP (3p22) cartilage associated protein Il complesso P3H1+CRTAP+CYPB (ciclofilina B) è responsabile dell’idrossilazione del residuo a1(I) Pro986: assenza di idrossilazione= collagene anormale e grave deficit di mineralizzazione ossea Le mutazioni LEPRE1 e CRTAP causa di OI sono del tipo “PERDITA DI FUNZIONE” 23 OI letale ricorrente 2. • Screening delle regioni codificanti di: • CRTAP (6 esoni + s.j.) : negativo • LEPRE1 (14 esoni + s.j.) : positivo • Mutazione (in omozigosi): c. 1391delC frameshift nell’esone 9, produce PTC nell’esone 10. 24 OI letale ricorrente 2: eredità AR Rischio di ricorrenza per la coppia: 25% 25 CONCLUSIONI • I dati molecolari mostrano la notevole eterogeneità genetica dell’OI • Nella maggior parte dei casi (>90%) il difetto è a carico dei geni collagenici (COL1A1/COL1A2) • Screening negativo e trasmissione AR suggeriscono ricerca in altri loci (CRTAP e LEPRE1) nelle forme gravi • Altri loci malattia potranno essere identificati in futuro 26 CLASSIFICAZIONE AGGIORNATA Sillence (>90%) Glorieux (<5%) Morello et al., Cabral et al. (5%) TIPO OMIM# EREDITA’ GENE I lieve II letale 166200 AD COL1A1 166210 AD COL1A1, COL1A2 III severo IV moderato V moderato VI mod/severo VII severo VIII letale 166210 AD COL1A1, COL1A2 166220 AD COL1A1, COL1A2 %610967 AD %610968 AD ? Collagene normale ? Collagene normale 610682 AR CRTAP 610915 AR LEPRE1 27