EXPERTEAM
PROGETTO BIOTECH 1 Regione Veneto
– LINEA DI RICERCA N. 14
Inquinamento virale in acqua e loro sedimenti:
l’utilizzo della PCR nelle determinazioni analitiche di
adenovirus quale indice di qualità.
Experteam nasce nel 1996 per opera dei biologi Angelo De Bortoli e
Federica Schiavon con una serie di kit innovativi in biologia
molecolare per la ricerca di virus, batteri, protozoi e per la ricerca di
malattie genetiche e tumori.
ATTIVITA’:
• ricerca
• produzione
• commercializzazione kit diagnostici
PRINCIPALI SETTORI DI ATTIVITA'
• Diagnostica genetica (microdelezioni cromosoma Y in pazienti oligo e azoospermici,
X fragile, fattori della coagulazione, emocromatosi)
• Diagnostica virale (HPV, CMV)
• Diagnostica batterica e parassitaria (m. tuberculosis e complex, b. burgdorferi,
ch. pneumoniae, p. carinii, t. gondii, g. lamblia)
• Diagnostica oncologica (linfomi B e T, traslocazioni cromosomiche)
• Determinazione di microorganismi negli alimenti (salmonella e listeria)
• Diagnostica
e monitoraggio ambientale
• Organizzazione e coordinamento corsi specialistici
SCOPO DEL PROGETTO
studio per la successiva produzione e messa in commercio di kit
diagnostici basati su metodologie di biologia molecolare per la
determinazione di virus, batteri e protozoi nelle acque costiere,
lagunari, fluviali e di scarico al fine di determinare:
• il rischio di contrarre patologie dall’uso ricreativo delle acque
analizzate (D.P.R. 155 del 1988: attuazione della direttiva 76/160/CEE relativa alla
qualità delle acque di balneazione)
• gli indici di qualità delle acque sulla base dei microrganismi e virus
presenti
• l’efficienza di sistemi di depurazione
• un determinato ceppo batterico o virale definendone quindi anche
l’origine (traceability).
VIRUS ENTERICI
virus escreti tramite le feci, caratterizzati dall’abilità ad infettare
principalmente i tessuti del tratto respiratorio e gastrointestinale
dell’uomo e dei mammiferi
Norwalk Epatite A
virus
Poliovirus
Enterovirus Rotavirus Adenovirus
Reovirus
Coxsackievirus
Echovirus
DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS
NELLE ACQUE
metodo tradizionale:
coltura cellulare
nuove biotecnologie:
RT-PCR
• tecnicamente complesso
• tecnicamente semplice
• lungo (10-30 gg. 1-3 passaggi BGM)
• rapido
• costoso
• poco costoso
• non sufficientemente sensibile
• altamente sensibile e specifico
METODO TRADIZIONALE
PRELIEVO
CAMPIONE POSITIVO:
Presenza di enterovirus
CONCENTRAZIONE E
DECONTAMINAZIONE
TECNICA DELL’
IMMUNOFLUORESCENZA
I PASSAGGIO SU
COLTURA CELLULARE
Monostrato di
cellule BGM
(Buffalo Green
Monkey). Sono
cellule di rene
di scimmia
verde africana
che hanno
particolare
suscettibilità
per i virus
enterici.
EFFETTO CITOPATICO
ASSENTE:
Probabile assenza
di virus enterici
CAMPIONE NEGATIVO:
Presenza di virus enterici e
Assenza di enterovirus
CAMPIONE POSITIVO:
Presenza di enterovirus
EFFETTO CITOPATICO
PRESENTE:
Presenza di virus enterici
TECNICA DELL’
IMMUNOFLUORESCENZA
II PASSAGGIO SU
COLTURA CELLULARE
EFFETTO CITOPATICO
ASSENTE:
Probabile assenza
di virus enterici
CAMPIONE NEGATIVO:
Presenza di virus enterici e
Assenza di enterovirus
CAMPIONE POSITIVO:
Presenza di enterovirus
EFFETTO CITOPATICO
PRESENTE:
Presenza di virus enterici
III PASSAGGIO SU
COLTURA CELLULARE
Tale metodo richiede da
un minimo di 10 ad un
massimo di 30 giorni.
EFFETTO CITOPATICO
ASSENTE:
TECNICA DELL’
IMMUNOFLUORESCENZA
CAMPIONE NEGATIVO:
Presenza di virus enterici e
Assenza di enterovirus
CAMPIONE NEGATIVO:
Assenza di virus enterici e di enterovirus
FASI DI MESSA A PUNTO DEL METODO
per la determinazione mediante PCR di
enterovirus, adenovirus, HAV
• Ricerca bibliografica
• Ottimizzazione della procedura di estrazione di RNA e DNA
• Ottimizzazione della fase di retrotrascrizione-amplificazione
(scelta primers, determinazione t. annealing, etc)
• Reperimento ed analisi di controlli positivi
• Campionamento ed analisi di campioni ambientali
• Confronto tra metodologie PCR e metodi tradizionali
RT-PCR per l’analisi di ENTEROVIRUS in campioni di
acque di scarico all’uscita dai depuratori
protocollo singolo step
protocollo PCR nested
1 2 3 4 5 6 7 8 CN
1 2 3 4 5 6 7 8 CN
CP 9 10 11 12 13 14 15 16
CP 9 10 11 12 13 14 15 16
PCR per l’analisi di ADENOVIRUS in campioni di acque
di scarico all’uscita dai depuratori
protocollo singolo step
TIPIZZAZIONE ADENOVIRUS
(sierotipi 40/41)
protocollo PCR nested
PROTOCOLLO OTTIMIZZATO
ENTEROVIRUS
ADENOVIRUS
• prelievo campione
• prelievo campione
• concentrazione campione
• concentrazione campione
• saggio su coltura cellulare
/
(1 passaggio BGM)
• estrazione RNA virale
• retrotrascrizione
• estrazione DNA virale
/
• PCR (I° ampl.)
• PCR (I° ampl.)
• PCR nested (II° ampl.)
• PCR nested (II° ampl.)
• elettroforesi gel agarosio
• elettroforesi gel agarosio
RISULTATI
CAMPIONI
ENTEROVIRUS (I° P BGM)
ADENOVIRUS (TQ)
acqua superficiale
EC
IF
PCR
PCR
PCR 40/41
9721
POS
POS
POS
POS
POS
9552
NEG
NEG
POS
POS
9554
NEG
NEG
POS
POS
1397
NEG
NEG
POS
POS
1398
NEG
NEG
NEG
1728
NEG
NEG
POS
2213
NEG
NEG
NEG
2219
NEG
NEG
POS
NEG
2389
NEG
NEG
POS
POS
2558
NEG
NEG
NEG
0485
POS
POS
POS
POS
/
0321
POS
POS
POS
POS
/
0706
POS
POS
NEG
POS
NEG
8970
NEG
NEG
POS
NEG
9761
NEG
NEG
POS
POS
2405
NEG
NEG
POS
POS
2450
NEG
NEG
POS
POS
NEG
acqua scarico
TOT. CAMPIONI
17
TOT. POSITIVI
ENTEROVIRUS
3
TOT. POSITIVI
ADENOVIRUS
14
RT-PCR per l’analisi di HAV
in campioni di acque di scarico
all’uscita dai depuratori
protocollo
singolo step
CP CN B
protocollo
PCR nested
CP CN
RT-PCR per l’analisi di REOVIRUS
in campioni di acque di scarico
all’uscita dai depuratori
protocollo
singolo step
CN CP B
protocollo
PCR nested
CN
1
2
3
PROTOCOLLO OTTIMIZZATO
HAV
REOVIRUS
• prelievo campione
• prelievo campione
• concentrazione campione
• concentrazione campione
• estrazione RNA virale
• estrazione RNA virale
• retrotrascrizione
• retrotrascrizione
• PCR (I° ampl.)
• PCR (I° ampl.)
• PCR nested (II° ampl.)
• PCR nested (II° ampl.)
• elettroforesi gel agarosio
• elettroforesi gel agarosio
Analisi di 39 campioni di acqua di scarico prelevati
all’uscita dei depuratori di 11 differenti siti nel periodo
aprile –agosto ’05.
CAMPIONI
ANALIZZATI
POSITIVI
ADENOVIRUS
POSITIVI
ENTEROVIRUS
POSITIVI
HAV
20 TQ
12 (60%)
1 (5%)
0 (0%)
19 IP
1 (5,3%)*
2 (10,5 %)*
0 (0%)
13 (33,3%)
3 (7,7%)
0 (0%)
TOT.
39
*I campioni positivi agli enterovirus sono stati analizzati mediante PCR specifica
per determinare se si trattava di poliovirus, coxsackie o echovirus, l’analisi ha
escluso la presenza di poliovirus .
VANTAGGI RISCONTRATI NELLA RICERCA DI
ADENOVIRUS RISPETTO ENTEROVIRUS E HAV:
• maggiore sensibilità
• materiale genetico di partenza DNA
• non necessaria la coltura cellulare
CONCLUSIONI
la ricerca di adenovirus, quali indicatori di inquinamento
fecale, è più semplice e sensibile rispetto a quella di
enterovirus, mentre la determinazione di HAV sembra non essere
significativa dato che nessuno dei campioni analizzati è risultato
positivo a tale determinazione.
MESSA A PUNTO DI METODICHE
PER PCR QUANTITATIVA
REAL TIME PCR metodica SYBR GREEN
Curve di amplificazione di 5 diluizioni (106,105,104,103,102 copie di genoma
virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5’ UTR di Enterovirus
REAL TIME PCR metodica TAQ-MAN
Curve di amplificazione di 5 diluizioni (106,105,104,103,102,10 copie di genoma
virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5’ UTR di Enterovirus
Analisi su due campioni d’acqua concentrata già
risultati positivi per la presenza di enterovirus con il kit
Experteam “Enterovirus kit 1”
Si sono determinati:
1) la quantità di carica virale presente mediante real time PCR
2) lo specifico ceppo (poliovirus, coxsackie o echovirus) mediante
sequenziamento
L’analisi quantitativa effettuata mediante Real Time PCR metodica Sybr
Green determinava una presenza di virus nei campioni concentrati 5000
volte pari a 0.2 e 0.3 UFP/ml (Unità Formanti Placca / ml).
L’analisi di sequenza ha necessitato la messa a punto di un nuovo
protocollo in grado di amplificare regioni variabili tra i diversi ceppi di
enterovirus. Le tre regioni analizzate e sequenziate sono state : 5’NTR,
VP1-2C, VP1-2.
Sequenza ottenuta
dall’amplificato 5’NTR
del campione 1
L’analisi in Gene Bank ha determinato
Campione 1: Coxsackievirus B1
Campione 2: Pur non giungendo ad una specifica tipizzazione si è
potuto escludere che si trattasse di un enterovirus di origine umana
già descritto in letteratura.
REAL TIME PCR metodica SYBR GREEN
Analisi di campioni
Determinazione di adenovirus
in campioni già risultati positivi
mediante pcr qualitativa.
Curve di amplificazione degli standard
CT = 27 → [500 copie/ml]
CT = 34 → [5 copie/ml]
Discussione
Il confronto tra la determinazione mediante PCR qualitativa e Real Time PCR
per la determinazione di enterovirus e adenovirus ha dimostrato come la
PCR qualitativa risulti più sensibile rispetto alla Real Time. D’altra parte tutti i
protocolli qualitativi utilizzati in questa fase erano “nested” mentre i protocolli
Real Time erano tutti a singolo step.
Un confronto tra la procedura quantitativa Taq-Man rispetto alla Sybr Green
ha dimostrato una maggiore sensibilità per la Sybr Green. Ulteriori prove
vanno però effettuate utilizzando maggiore quantità di acidi nucleici nella
miscela di amplificazione.
DETERMINAZIONE DI ADENOVIRUS
NEL CAMPIONE DI SEDIMENTO
MEDIANTE NESTED PCR
INIBITORI DELLA PCR NEL SEDIMENTO
Nell’ambito dell’amplificazione di adenovirus per l’eliminazione dell’effetto
inbitore sono state provate 4 diverse procedure:
1.
aggiunta di polivinilpolipirrolidone (PVPP) durante la procedura di
estrazione
2.
aggiunta di PVPP alla miscela di amplificazione
3.
aggiunta della proteina di “T4 gene Protein” alla miscela di amplificazione
4.
diluizione da 1/10 a 1/10.000 del DNA estratto
I risultati migliori si sono ottenuti con le procedure 3 e 4:
• l’aggiunta della “T4 gene Protein” permette di non
diluire il DNA estratto
• la procedura di diluizione non necessita dell’aggiunta
di un ulteriore reagente. Non permette, però, di
conoscere a priori il fattore di diluizione ideale per ogni
campione
1 2 3 4 5 6 7
Campioni con aggiunta della T4 Gene
32 Protein
8 9 10 11 12 13 1415 16
Campioni diluiti da 1:10 a 1:10000
L’utilizzo dello strumento “FastPrep
Instrument” (prodotto da Q-Biogene) ha
reso
notevolmente
più
semplice,
sensibile e ripetibile l’estrazione del DNA
e del RNA da sedimento rispetto ad altri
metodi finora utilizzati.
CONCLUSIONI ATTIVITA’ DI RICERCA
(sett. 04 – dic. 05)
• Messa a punto di 6 kit in PCR qualitativa (enterovirus, poliovirus,
adenovirus, adenovirus 40 e 41, HAV e reovirus) e 2 kit in PCR quantitativa
(enterovirus e adenovirus)
• La determinazione mediante PCR di adenovirus risulta la migliore come
indice di contaminazione ambientale in quanto più sensibile, rapida e
semplice, sia in acque concentrate che nel sedimento, rispetto alla ricerca di
altri virus o microrganismi
• Data la complessità delle matrici (acque concentrate e sedimenti) va posta
particolare attenzione nella fase di estrazione degli acidi nucleici soprattutto
per la presenza di inibitori della Taq-polimerasi
• I laboratori italiani che si occupano di monitoraggio ambientale hanno
dimostrato forte interesse per l’attività svolta, questo fa intuire un notevole
successo di mercato dei prodotti e servizi sviluppati in tale ricerca.
Analisi delle acque di scarico, prelevati all’uscita dei
depuratori di 11 differenti siti già precedentemente
analizzate, con l’aggiunta delle determinazioni di
reovirus, norwalk virus e rotavirus.
- campione negativo
+ campione positivo
/ campione non analizzato
L’analisi dei reovirus sono state effettuate sia sul campione TQ
(campione di acqua sottoposto solamente al trattamento di
decontaminazione e concentrazione) sia sul campione BGM (campione
di acqua al quale è stato effettuato anche un passaggio di coltura
cellulare su cellule BGM): nessun campione è risultato positivo.
L’analisi di norwalk e rotavirus è stata effettuata solamente sul
campione TQ in quanto tali virus non crescono su una coltura di cellule
BGM.
SITO 7
Data
prelievo
Campione
ROTAVIRU
S
Nested
20504479
TQ
27/04/05
+
SITO 3
Campione
6497
TQ
Data
prelievo
NORWALK
05/07/05
?
Nested
SITO 8
Data
prelievo
Campione
NORWAL
K
Nested
20508843
TQ
02/08/05
L’analisi del sito 7 ha rilevato positività ai rotavirus,
il dato è stato successivamente confermato
mediante sequenziamento.
?
L’analisi dei siti 3 e 8 ha rilevato una probabile
positività ai norwalk virus, il dato dovrà essere
confermato mediante sequenziamento.
SITO 3
6497
SITO 3
9805
50°C
53°C
55°C
57°C
60°C
50°C
53°C
55°C
57°C
60°C
50°C
53°C
55°C
57°C
60°C
Marcatore
SITO 4
9382
Rotavirus
Campione probabilmente positivo da
verificare mediante sequenziamento
SITO 8
8843
SITO 7
4479
50°C
53°C
55°C
57°C
60°C
50°C
53°C
55°C
marcatore
Norwalk virus
Campione positivo, verificato
con sequenziamentro
Sequenza dell’amplificato di rotavirus
Analisi dei risultati ottenuti e confronto tra la positività riscontrate ai
diversi virus analizzati, alla presenza di E. coli (determinazione effettuata
per noi da ARPAV) ed al tipo di disinfezione presente nei diversi siti
E.Coli (UFC/100ml)
UFC: unità formanti colonia
E.Coli (UFC/100ml)
NaClO → ipoclorito di sodio
CH3CO3H → acido peracetico
I dati ottenuti hanno confermato ulteriormente come gli adenovirus risultino i
migliori indicatori di contaminazione virale delle acque e che il trattamento di
disinfezione migliore risulti quello con ipoclorito di sodio rispetto all’utilizzo di
acido peracetico o al trattamento con radiazioni UV.
Interessante l’analisi del sito 4, dove ad un’elevata presenza di E. coli si
somma la positività all’analisi di enterovirus (unico sito positivo), la positivita’
ad adenovirus e l’utilizzo di radiazioni UV come metodo di disinfezione.
Scelta dei siti di campionamento
Sono stati scelti 10 siti lagunari di campionamento, nei quali sono stati
prelevati 10 litri d’acqua e 100 gr di sedimento mediante una benna o
un carotatore, in base alla possibile presenza o meno di virus Enterici
-Sito SA1: Mulino Stucky - Canale dei Lavraneri
-Sito SA2: Rialto - Canal Grande
-Sito SA3: Ospedale Fatebenefratelli - Rio di Zecchini
-Sito SA4: Ospedale SS. Giovanni e Paolo - Fondamenta nuove
-Sito SA5: Santa Marta - Rio delle Terese
-Sito SA6: Ca’ Giustiniani - Rio delle Eremite
-Sito SA7: Marghera - Canale Vittorio Emanuele
-Sito SA8: Fusina - Naviglio del Brenta
-Sito SA9: Marghera (zona industriale) - Canale dei Petroli
-Sito SA10: Arsenale - Canale di San Pietro
• Siti SA3, SA4 e SA10 probabilmente positivi perchè situati nelle vicinanze di
Ospedali
• Siti SA2, SA5 e SA6 probabilmente positivi perchè localizzati in canali nei quali
vengono scaricate acque reflue
• Siti SA1 e SA7 probabilmente negativi perchè situati in aree con notevole ricambio
d’acqua
• Siti SA8 e SA9 presi in considerazione perchè vicini alla zona industriale di
Marghera e Fusina
SA3
SA4
SA2
SA10
SA5
SA6
SA1
SA9
SA8
SA7
Carotatore utilizzato per i
prelievi di sedimento
Benna utilizzata per i prelievi di
sedimento
I campioni di acqua prelevati da ogni sito (10 L) sono stati conservati a +4°C per un
periodo massimo di due giorni. Sono stati sottoposti al trattamento di
decontaminazione e concentrazione, quindi utilizzati per inoculare un monostrato di
cellule BGM di coltura cellulare. Sono stati considerati positivi ai virus enterici i
campioni che determinavano effetto citopatico dopo un unico passaggio su coltura
cellulare (10 giorni).
I campioni di sedimento prelevati da ogni sito (100 gr) sono stati conservati a -20°C
per un periodo massimo di due giorni. E’ stata quindi effettuata l’estrazione del DNA
mediante il FastDNA® SPIN Kit for Soil e il FastPrep® Instrument (Qbiogene) e
dell’RNA mediante il FastRNA Pro Soil Direct Kit e il FastPrep® Instrument
(Qbiogene).
I campioni di DNA ed RNA estratti sono stati analizzati mediante i vari kit Experteam
per la determinazione qualitativa dei diversi virus enterici.
Tabella risultati sedimento e acque
Sito
H2O
effetto
citopatico
Sedimento
Adenovirus
Sedimento
Enterovirus
Sedimento
HAV
Sedimento
Reovirus
Sedimento
Rotavirus
Sedimento
Norwalk
virus
SA1
+/+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
-
SA2
SA3
SA4
SA5
SA6
SA7
SA8
SA9
SA10
Conclusioni relative ai dati sui sedimenti
I siti nei quali si riscontra una maggiore positività ai virus Enterici (Adenovirus,
HAV e Rotavirus) sono i siti SA1 ed SA4. Il sito SA4 è situato nelle vicinanze
dell’Ospedale SS. Giovanni e Paolo. Le acque reflue dell’Ospedale vengono scaricate
direttamente in acqua ed è probabile che contengano una maggiore quantità di virus, quindi
è plausibile che questo sito sia maggiormente contaminato rispetto ad altri. E’ da chiarire,
invece, la causa della positività del sito SA1.
Il sito SA3 mostra una debole positività agli Enterovirus nel sedimento e un debole effetto
citopatico nelle acque. Questo dato può indicare una correlazione tra presenza di virus nel
sedimento e nell’acqua circostante e può confermare l’ipotesi che il sedimento funga da
serbatoio di virus presenti nell’acqua.
I siti SA2, SA6 ed SA10 sono positivi ai Rotavirus, probabilmente perché le acque reflue
della zona sono scaricate direttamente in acqua e nei canali nei quali è stato effettuato il
campionamento non vi è un grande ricircolo d’acqua.
L’acqua del sito SA8 ha una temperatura superiore alla media, data la presenza degli
scarichi della centrale elettrica, e questo può spiegare la positività ai Rotavirus ma non ad
altri virus enterici, dato che i Rotavirus sono riscontrati più frequentemente alle temperature
più elevate.
Il sito SA5 è risultato negativo per tutti i virus Enterici a RNA.
I siti SA7 e SA9 sono risultati negativi a tutte le analisi per i virus Enterici a RNA
probabilmente perché situati in una zona con grande ricircolo d’acqua e nella quale non vi è
scarico di acque reflue.
Conclusioni
Dall’analisi dei dati riportati in tabella risulta come la determinazione
qualitativa di adenovirus nel sedimento risulti di poca rilevanza, dato
che tutti i siti analizzati sono risultati positivi. Sarà quindi necessario effettuare la medesima analisi mediante real time PCR (PCR quantitativa) al fine
di individuare una possibile scala del livello di inquinamento.
Particolarmente interessante in tale ambito risultano invece le determinazioni di HAV
e rotavirus, in quanto i campioni di acqua analizzati precedentemente erano sempre
risultati negativi a tali virus.
Nessun campione analizzato è invece risultato positivo per l’analisi di norwalk virus e
reovirus.
Appare quindi evidente, anche se in via preliminare, come il significato dei diversi
virus enterici rilevabili mediante PCR assuma valore diverso a seconda del tipo di
campione analizzato (acqua o sedimento).I dati relativi al sedimento risultano
comunque di difficile interpretazione non essendo ancora stata effettuata alcuna
analisi in PCR sui campioni di acqua corrispondenti. Ulteriori informazioni si potranno
ottenere dall’analisi mediante real time PCR di acqua e sedimento.
PROTOTIPI KIT ALLESTITI
Adenovirus Kit 1 RQ
Sistema completo per la quantificazione di Adenovirus in campioni
ambientali mediante Real Time PCR. La determinazione quantitativa
oltre ad indicare un potenziale rischio sanitario, soprattutto per le
categorie a rischio quali bambini, anziani, pazienti immunosoppressi,
costituisce un indice di qualità dell’acqua per il suo utilizzo in ambito
potabile, ricreativo e lavorativo.
Campioni d’acqua
Concentrazione
Estrazione DNA
PCR QUANTITATIVA
Risultato : copie di genoma di Adenovirus presenti nel
d’acqua concentrato per ml
campione
