Immunologia e Immunologia
Diagnostica
TECNICHE IMMUNOLOGICHE
Tecniche di laboratorio
• La maggior parte delle tecniche di laboratorio
biomedico si basano sull’utilizzo degli anticorpi.
• Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata
specificità.
• Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere
ogni tipo di molecola biologica o chimica:
- Proteine
- Acidi nucleici
- Lipidi
- Polisaccaridi
- Sostanze chimiche
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Applicazioni degli anticorpi
monoclonali
• Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati:
- Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica
- Nei laboratori di diagnostica
- Nelle terapie mediche
• Gli anticorpi monoclonali permettono di:
- Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo)
- Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo)
- Purificare l’antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere)
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Concetto di antigene nelle
applicazioni pratiche
Dal punto di vista biologico l’antigene è sempre una
molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile
per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte
sostanze presenti nel sangue:
Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue
Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni
2. Titolo anticorpale
Marker tumorali = Diagnostica per immagini
Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico
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Proprietà pratiche nell’utilizzo
degli anticorpi
Il riconiscimento dell’antigene da parte di un anticorpo è
basato su legami chimici che determineranno:
L’affinità dell’anticorpo
L’avidità dell’anticorpo
La specificità dell’anticorpo
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Reazioni
Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab)
Interazione Lisozima/Anti-Lisozima
• Modello Chiave-Serratura
• Legami non covalenti:
Ag
– Legami Idrogeno
– Legami Elettrostatici
– Legami Idrofobici
• Molti legami tra Ag e Ab
• Processo Reversibile
H
L
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Affinità Anticorpale
• La forza della reazione tra un singolo determinante
antigenico ed un singolo sito di legame dell’anticorpo
Alta Affinita’
Bassa Affinita’
Ab
Ab
Ag
Ag
Affinita’ = Somma delle forze attrattive e repulsive
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Avidità Anticorpale
• La forza totale del legame tra un Ag con molti determinanti
e Abs multivalenti
Keq =
104
Affinita’
106
Avidita’
1010
Avidita’
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Specificità Anticorpale
• La capacita’ per un singolo anticorpo di
reagire contro un solo determinante
antigenico.
• La capacita’ per una popolazione di anticorpi
di reagire contro un solo antigene.
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Reazione Incrociata
(Cross-Reazione)
• La capacita’ di un singolo anticorpo di reagire contro
piu’ determinanti antigenici.
• La capacita’ di una popolazione di anticorpi di reagire
contro piu’ antigeni.
Cross-Reazioni
AntiA Ab
AntiA Ab
AntiA Ab
Ag A
Ag B
Ag C
Epitopo condiviso
Epitopo simile
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Test Basati sulle Reazioni
Ag/Ab
• Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab
permettono di misurare piccole quantita’ degli
immuno-complessi.
• Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab
possono essere utilizzati per misurare
l’antigene o l’anticorpo presenti nel campione.
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Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay (ELISA):
Saggio di Immunoassorbimento
Legato ad Enzima Principio dell’ELISA
• 1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra
• 1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima
• L’enzima (perossidasi) reagisce con il substrato
• La reazione produce una colorazione misurabile
Substrato
incolore
Anti-Ig
marcato
Substrato
dopo la
reazione
Enzima
Ab
specifico
Piastra ELISA
Ag
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ELISA Diretto per Ag
• Rilevamento dell’Ag
– Immobilizare l’Ab
– Incubare con il campione
da misurare
– Aggiungere l’Ab marcato
con un enzima
– La quantita’ di Ab legato
e’ proporzionale alla
quantita’ di Ag nel
campione del paziente.
Ab
marcato
Ag nel campione
del paziente
Ag
Immobilizato
Fase
Solida
Test Quantitativo
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ELISA Diretto per Ab
• Rilevamento dell’Ab
– Immobilizare l’Ag
– Incubare con il
campione da misurare
– Aggiungere l’anti-Ig
marcato con un enzima
– La quantita’ di anti-Ig
legato e’ proporzionale
alla quantita’ di Ab nel
campione del paziente.
Anti-Ig
marcato
Ab nel campione
del paziente
Immobilizato
Ag
Fase
Solida
Test Quantitativo
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Immunofluorescenza
e
Citofluorimetria
Immunofluorescenza
• Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag
Antigeni sulla membrana citoplasmatica:
- direttamente accessibili
Antigeni intracellulari:
- inaccessibili senza trattamento preventivo
1) Fissazione
2) Permeabilizzazione
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Immunofluorescenza
• Preparazione dei campioni → Marcatura Ab
Traccianti Fluorescenti:
-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag
- Fino a 4 traccianti diversi per un campione
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Fluorescenza e Fluorocromi
• I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti
fluorescenti:
-Assorbono l’energia della luce → Eccitazione
-Emettono fluorescenza nel visibile → Emissione
Fluorocromo
Eccitazione (nm)
Emissione (nm)
Fluoresceina
(FITC)
495
519
Rodammina
550
573
Ficoeritrina
(PE)
565
578
Texas Red
589
615
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Immunofluorescenza
• Diretta:
- L’anticorpo che riconosce l’antigene e’ marcato con un
fluorocromo (molecola fluorescente)
Ab marcato con
fluorocromo
Ag
Sezione di un tessuto
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Immunofluorescenza
• Indiretta:
- L’Ab che riconosce l’Ag
non e’ marcato
- Viene utilizzato un anti-Ig
marcato con un fluorocromo
per rilevare il legame del
primo Ab.
Ab non
marcato
Anti-Ig marcato
con fluorocromo
Ag
Sezione di un tessuto
Test Qualitativo/Semi-Quantitativo
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Immunofluorescenza
Area T
(Paracorticale)
Area B
(Follicoli)
Linfociti T e B all’interno di un linfonodo
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Immunofluorescenza
• Analisi di Tessuti
• Analisi di Singole Cellule
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Citofluorimetria
• Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag
Antigeni sulla membrana citoplasmatica:
- direttamente accessibili
Antigeni intracellulari:
- inaccessibili senza trattamento preventivo
1) Fissazione
2) Permeabilizzazione
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Citofluorimetria
• Preparazione dei campioni → Marcatura Ab
Traccianti Fluorescenti:
-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag
- Fino a 8 traccianti diversi per un campione
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Citofluorimetria
• La sospensione di cellule da analizzare viene marcata
con una molecola fluorescente.
• La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o
Indiretta.
• Il campione di cellule viene analizzato con un
citofluorimetro (FACS)
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Citofluorimetria
• Analisi del campione al FACS
Numero di Cellule
Cellule non marcate
Cellule fluorescenti
Intensita’ Fluorescenza Verde
Istogramma con 2 Parametri
Intensita’ Fluorescenza Verde
Istogramma con 1 Parametro
3
4
1
2
Intensita’ Fluorescenza Rossa
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Citofluorimetria
• Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
- Miscela di linfociti, monociti e granulociti
- Colorazione con Ab monoclonali:
1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con
ficoeritrina (PE)
2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti:
linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina
(FITC)
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Citofluorimetria
• Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
con 1 parametro
CD45 FITC
3
CD45=linfociti>monociti>granulociti
(1)
(2)
(3)
2 1
CD14 PE
CD14=monociti
Intensita’ Fluorescenza
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Citofluorimetria
• Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
con 2 parametri
CD14 PE
CD14=monociti
CD45=linfociti>monociti>granulociti
R1=monociti (CD14+)
R2=linfociti (CD45>monociti)
R3=granulociti (CD45<monociti)
CD45 FITC
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