Tecniche Immunologiche
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Immunologia e Immunologia Diagnostica TECNICHE IMMUNOLOGICHE Tecniche di laboratorio • La maggior parte delle tecniche di laboratorio biomedico si basano sull’utilizzo degli anticorpi. • Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata specificità. • Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola biologica o chimica: - Proteine - Acidi nucleici - Lipidi - Polisaccaridi - Sostanze chimiche Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Applicazioni degli anticorpi monoclonali • Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati: - Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica - Nei laboratori di diagnostica - Nelle terapie mediche • Gli anticorpi monoclonali permettono di: - Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo) - Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo) - Purificare l’antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere) Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Concetto di antigene nelle applicazioni pratiche Dal punto di vista biologico l’antigene è sempre una molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte sostanze presenti nel sangue: Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni 2. Titolo anticorpale Marker tumorali = Diagnostica per immagini Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Proprietà pratiche nell’utilizzo degli anticorpi Il riconiscimento dell’antigene da parte di un anticorpo è basato su legami chimici che determineranno: L’affinità dell’anticorpo L’avidità dell’anticorpo La specificità dell’anticorpo Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab) Interazione Lisozima/Anti-Lisozima • Modello Chiave-Serratura • Legami non covalenti: Ag – Legami Idrogeno – Legami Elettrostatici – Legami Idrofobici • Molti legami tra Ag e Ab • Processo Reversibile H L Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Affinità Anticorpale • La forza della reazione tra un singolo determinante antigenico ed un singolo sito di legame dell’anticorpo Alta Affinita’ Bassa Affinita’ Ab Ab Ag Ag Affinita’ = Somma delle forze attrattive e repulsive Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Avidità Anticorpale • La forza totale del legame tra un Ag con molti determinanti e Abs multivalenti Keq = 104 Affinita’ 106 Avidita’ 1010 Avidita’ Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Specificità Anticorpale • La capacita’ per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico. • La capacita’ per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene. Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Reazione Incrociata (Cross-Reazione) • La capacita’ di un singolo anticorpo di reagire contro piu’ determinanti antigenici. • La capacita’ di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu’ antigeni. Cross-Reazioni AntiA Ab AntiA Ab AntiA Ab Ag A Ag B Ag C Epitopo condiviso Epitopo simile Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab • Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantita’ degli immuno-complessi. • Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l’antigene o l’anticorpo presenti nel campione. Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima Principio dell’ELISA • 1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra • 1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima • L’enzima (perossidasi) reagisce con il substrato • La reazione produce una colorazione misurabile Substrato incolore Anti-Ig marcato Substrato dopo la reazione Enzima Ab specifico Piastra ELISA Ag Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it ELISA Diretto per Ag • Rilevamento dell’Ag – Immobilizare l’Ab – Incubare con il campione da misurare – Aggiungere l’Ab marcato con un enzima – La quantita’ di Ab legato e’ proporzionale alla quantita’ di Ag nel campione del paziente. Ab marcato Ag nel campione del paziente Ag Immobilizato Fase Solida Test Quantitativo Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it ELISA Diretto per Ab • Rilevamento dell’Ab – Immobilizare l’Ag – Incubare con il campione da misurare – Aggiungere l’anti-Ig marcato con un enzima – La quantita’ di anti-Ig legato e’ proporzionale alla quantita’ di Ab nel campione del paziente. Anti-Ig marcato Ab nel campione del paziente Immobilizato Ag Fase Solida Test Quantitativo Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunofluorescenza e Citofluorimetria Immunofluorescenza • Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag Antigeni sulla membrana citoplasmatica: - direttamente accessibili Antigeni intracellulari: - inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunofluorescenza • Preparazione dei campioni → Marcatura Ab Traccianti Fluorescenti: -1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag - Fino a 4 traccianti diversi per un campione Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Fluorescenza e Fluorocromi • I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti: -Assorbono l’energia della luce → Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile → Emissione Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm) Fluoresceina (FITC) 495 519 Rodammina 550 573 Ficoeritrina (PE) 565 578 Texas Red 589 615 Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunofluorescenza • Diretta: - L’anticorpo che riconosce l’antigene e’ marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente) Ab marcato con fluorocromo Ag Sezione di un tessuto Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunofluorescenza • Indiretta: - L’Ab che riconosce l’Ag non e’ marcato - Viene utilizzato un anti-Ig marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab. Ab non marcato Anti-Ig marcato con fluorocromo Ag Sezione di un tessuto Test Qualitativo/Semi-Quantitativo Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunofluorescenza Area T (Paracorticale) Area B (Follicoli) Linfociti T e B all’interno di un linfonodo Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunofluorescenza • Analisi di Tessuti • Analisi di Singole Cellule Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag Antigeni sulla membrana citoplasmatica: - direttamente accessibili Antigeni intracellulari: - inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • Preparazione dei campioni → Marcatura Ab Traccianti Fluorescenti: -1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag - Fino a 8 traccianti diversi per un campione Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • La sospensione di cellule da analizzare viene marcata con una molecola fluorescente. • La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o Indiretta. • Il campione di cellule viene analizzato con un citofluorimetro (FACS) Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • Analisi del campione al FACS Numero di Cellule Cellule non marcate Cellule fluorescenti Intensita’ Fluorescenza Verde Istogramma con 2 Parametri Intensita’ Fluorescenza Verde Istogramma con 1 Parametro 3 4 1 2 Intensita’ Fluorescenza Rossa Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • Esempio: Analisi cellule da sangue periferico - Miscela di linfociti, monociti e granulociti - Colorazione con Ab monoclonali: 1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE) 2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC) Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • Esempio: Analisi cellule da sangue periferico con 1 parametro CD45 FITC 3 CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3) 2 1 CD14 PE CD14=monociti Intensita’ Fluorescenza Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it Citofluorimetria • Esempio: Analisi cellule da sangue periferico con 2 parametri CD14 PE CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti) CD45 FITC Immunologia e Immunologia Diagnostica didattica.uniroma2.it
