Presentazione standard di PowerPoint

PROGETTO
“DNA CHIAVI
IN MANO”
La collaborazione con il
Virgilio e il progetto
dell’ IFOM
Il progetto DNA chiavi in
mano è un percorso pensato
dal Centro di Ricerca internazionale
IFOM per avvicinare i ragazzi al
mondo della ricerca. Grazie alla
collaborazione di un ricercatore della
Bicocca, delle Docenti del Maxwell e
del Virgilio e dell’utilizzo delle
attrezzature di tale Istituto, gli studenti
della 4°ALST hanno potuto realizzare
il progetto e lavorare per tre giornate
sull’ unità base della vita: il DNA.
Le fasi del progetto
• Estrazione del DNA genomico dalla
mucosa boccale
• Corsa elettroforetica su gel di Agarosio
• PCR (reazione a catena della polimerasi)
• Digestione enzimatica del DNA del
fago λ con HIND III o EcoRI e corsa
elettroforetica su gel di agarosio
• Pomeriggio al centro
di ricerca IFOM di
Milano e visita
dei laboratori
Estrazione del DNA genomico
dalla mucosa boccale
Tramite spazzolino sterile si è estratto dalla mucosa
boccale materiale genetico, riposto in provette e
immerso in una soluzione per rompere le membrane
e liberare il Dna legato alle proteine.
Il materiale è stato miscelato e incubato a 100° per
denaturare le proteine.
L’ aggiunta di una nuova soluzione ha fatto precipitare
le proteine rendendole insolubili.
Centrifugando il tutto, i frammenti di membrana e le
proteine (pellet) si sono depositati sul fondo e in
superficie il surnatante contenente il DNA.
Con l’aiuto di una micropipetta, il DNA è stato poi
trasferito in una provetta contenente isopropanolo freddo
utile a far precipitare il Dna, essendo quest’ultimo
insolubile in alcool.
Fatto evaporare l’isopropanolo IL DNA rimane
visibile in soluzione con l’aggiunta del benzetilene *
e reso fluorescente grazie all’intercalante.
Un intercalante è una molecola di tipo planare in
grado di inserirsi nei filamenti di DNA.
Grazie alle loro proprietà idrofobe, gli agenti
intercalanti sono in grado di inserirsi tra
due basi azotate lungo i filamenti della doppia elica.
*E’ stato utilizzato il benzetilene
invece del bromuro di etidio
che è cancerogeno
Ed ecco il
risultato!
La zona bianca che si
vede in superficie è il
nostro Dna boccale.
Si è rimasti colpiti dalle
piccolissime quantità
con cui i ricercatori
lavorano ogni giorno: si
è prelevato quantità
dell’ordine dei μl (un
milionesimo di litro).
Corsa elettroforetica su gel d’agarosio
La corsa elettroforetica è’ un metodo di
separazione di campioni basato sulla diversa
velocità di migrazione di particelle
elettricamente cariche attraverso una soluzione
tampone .
I frammenti di Dna migrano verso il polo
positivo perché il gruppo fosfato presente nella
loro struttura li carica negativamente
Abbiamo digerito il DNA di un determinato tipo
di fago tramite l’utilizzo di specifici enzimi di
restrizione quali Hind III e EcoRI.
Per l’allestimento della cella elettroforetica abbiamo sigillato i lati di una vaschetta con nastro adesivo,
inserito in essa un pettine per la creazione di pozzetti. Quindi abbiamo colato il gel di agarosio nella
vaschetta e aspettato che si solidificasse(il gel diventa opaco solidificando).Eliminare il pettine ed il nastro
quindi inserire la vaschetta nella cella elettroforetica. Caricare in ogni pozzetto i campioni di DNA
digerito ed i controlli negativi.
Con l’aiuto di un ricercatore
abbiamo preparato il gel di
agarosio al 1%. L’agarosio è
un polisaccaride che agisce
come una ragnatela attraverso
la quale passeranno i
frammenti di Dna.
Allestita la cella
elettroforetica ( supporto
specifico per l’esperimento) e
creato i pozzetti dopo
solidificazione del gel,
abbiamo aggiunto una
soluzione tampone fino a
ricoprire
completamente il gel : la vaschetta era pronta per la corsa del Dna campione.
Tramite micropipetta (..e polso fermo !!) abbiamo posizionato in ogni pozzetto
20μl di campione di Dna e fatto correre per 25 minuti a 120 V .
PCR: reazione a catena
della polimerasi
La PCR è una tecnica di biologia molecolare che
consente, partendo da un piccolissimo campione di
DNA, di sintetizzarne in vitro milioni di copie del
segmento in poche ore.Con una successione di
riscaldamenti e raffreddamenti la Dna polimerasi riesce,
partendo da serie di nucleotidi conosciuta (i primer)
complementare al Dna di partenza, a duplicare più volte
il campione di Dna.
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La miscela di reazione che abbiamo preparato
contiene piccolissimi volumi di materiale
perché la Pcr lavora in piccole quantità. La
soluzione contiene:
Sequenza di DNA che si vuole amplificare
Sequenza di nucleotidi che funge da primer,
dNTPS
Gli NTPs (o nucleosidi trifosfato) sono
molecole che servono a fornire l'energia
necessaria per far avvenire la duplicazione
(durante la PCR).
Tali molecole sono composte da uno
zucchero a cinque atomi di carbonio
(deossiribosio o ribosio) legato ad una base
azotata e a tre gruppi fosfato.
Per perdita di gruppi fosfato possiamo
ottenere NDPs (nucleosidi difosfato) o NMPs
(nucleosidi monofosfato).
Sequenza di nucleotidi che funge da primer,
dNTPS.
Abbiamo inserito la provetta nel
termociclatore, strumento che ci
permette di eseguire più cicli di
riscaldamento ( per separare i due
filamenti della doppia elica di DNA) e
raffreddamento (per permettere ai
primer di attaccarsi alle loro sequenze
complementari ) con tempi diversi.
Le molecole di DNA polimerasi,
riconosciute le sequenze innesco,
cominciano ad aggiungere nucleotidi a
partire da siti in cui si sono attaccate
tali sequenze. Abbiamo ripetuto il
processo una ventina di volte.
Abbiamo allestito la cella elettroforetica con il
gel di Agarosio e fatto la corsa elettroforetica
disponendo i frammenti di DNA in un campo
elettrico generato dalla differenza di potenziale
applicata a due elettrodi, migrati verso il polo
positivo perché carichi negativamente.
Terminata la corsa abbiamo visualizzato
su una lampada a luce blu, le copie del
Dna prodotte con la PCR
Digestione enzimatica del DNA del fago λ con
HIND III ed EcoRI
Il DNA usato è quello del fago lambda: è il
substrato che verrà tagliato dall’enzima Hind III
in punti ben precisi.
Poichè è conosciuta la dimensione in paia di basi
di ogni banda, si può usare il DNA del fago
lambda come marcatore di peso molecolare per
trovare la dimensione approssimativa di bande
ignote tramite un confronto (se composte da un
numero simile di paia di basi le bande si
fermeranno alla stessa altezza del gel).
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L’enzima utilizzato è
l’Eco RI, enzima di
restrizione capace di
tagliare il Dna ogni volta
che incontra una sequenza
di basi azotate
prestabilita.
Il tampone (presente
nella cella
elettroforetica) serve
per ottenere un
ambiente di reazione
stabile e gli ioni Mg ++
come cofattori.
I due enzimi utilizzati possiedono due diversi siti di restrizione. Il frammento di DNA carichi
negativamente per i residui di fosfato migrano attraverso la griglia molecolare di agarosio
verso il polo positivo.
L’enzima EcoRI taglia ogni volta che incontra la sequenza: CTTAAG (o la sua
complementare). Il taglio verrà quindi effettuato tra la A e la G.
Tramite il transilluminatore abbiamo potuto
leggere i risultati della nostra corsa.
Comparando i risultati con campioni standard
siamo riusciti ad avere una misura indicativa dei
tratti di Dna che abbiamo fatto correre:
maggiore è la corsa del campione minore
sarà il numero di coppie di nucleotidi
costituenti e più facile sarà il passaggio
attraverso la fitta rete di Agarosio.
Visita ai laboratori di ricerca
Alla fine dell’esperienza, ma non per ultima di importanza, abbiamo visitato i laboratori dei
centri di ricerca internazionali dell’IFOM (istituto FIRC di oncologia molecolare).
Siamo rimasti un po’ stupiti perché ci aspettavamo di vedere gli enormi stanzoni che si vedono
nei film; invece per ogni ricercatore è previsto un piccolo banco di lavoro con mille strumenti
e reagenti, mentre in camere apposite sono riposte attrezzature più ingombranti e pericolose.
Al termine della visita,
abbiamo ” interrogato” le
guide sui programmi di
ricerca attuali e iniziative
future, sulle opportunità
di lavoro , riuscendo a
capire come e dove
operano i giovani scienziati
e compreso cosa vuol dire
essere ricercatore.
Il mondo della ricerca ci è
parso più vicino!
Le nostre impressioni
Nonostante il nostro laboratorio sia molto fornito,
questa esperienza è stata molto positiva perché
abbiamo utilizzato attrezzature particolari e compreso
come si lavora nei laboratori di ricerca. Supportati
anche dalle insegnanti e da un giovane ricercatore
che ci ha seguito nelle attività ed aiutato a
comprendere meglio ciò che stavamo facendo,
il progetto è servito a realizzare e rendere più
efficace ciò che avevamo appreso a livello
teorico ed avvicinarci al mondo
professionale della ricerca
e della sperimentazione
Scientifica.
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AL LAVORO!!!
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Realizzato dalla 4°A liceo scientifico tecnologico
a.s. 2012 -2013
Docenti: Nadia Galvagno – Pasqua Losciale
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