LE PROTEINE DELLA FASE ACUTA, UN AGGIORNAMENTO AL 2009
Incontro SIMIV – Cremona, 15 Marzo 2009
Come si articola la reazione di fase acuta
Midollo osseo
LEUCOCITOSI
( proliferazione midollare )
GM-CSF
Virus
LPS batterici
necrosi
tessuti lesionati
Fibroblasti
Endoteli
IL-1
TNFα
Le APP nel gatto: interessi e limiti.
Monociti/macrofagi
Cenni relativi all’
all’utilizzo clinico delle
APP nelle altre specie
Centri
termoregolatori
ipotalamici
Centro
della fame
Alessia Giordano
DVM, PhD,
PhD, Dipl.ECVCP
Cheratinociti
IL-1
TNFα
IL-6
IL-1
TNFα
IL-6
Epatociti
Surrene
Ipofisi
Glucocorticoidi
ACTH
ANORESSIA
Dipartimento di Patologia Animale
Igiene e Sanità
Sanità Pubblica Veterinaria
Come si articola la reazione di fase acuta
Cellule muscolari
FEBBRE
LEUCOCITOSI
(distacco pool marginale)
PROTEINE DI FASE ACUTA
APP e APR: ruolo centrale del fegato
catabolismo muscolare
TNFa
Se il fegato non funziona: sintesi APP ridotta o assente anche in corso di flogosi
(malnutrizione, cachessia, ipofunzionalità epatica…..)
APP
Aminoacidi
IL-1
Produzione anche extraepatica soprattutto come risposta locale (es. mammella)
APP
APP
Epatociti
Kupffer cells
IL-6
Indotta anche da glucocorticoidi
APP: PRINCIPALI CARATTERISTICHE
APP e APR: ruolo centrale delle citochine proinfiammatorie
IL1, IL6, TNFa
•La risposta di fase acuta si sviluppa prima
della risposta specifica
Aumento APP PRECOCE (anche prima dei sintomi)
Perché allora si misurano le proteine di fase acuta e non le citochine?
Molecole molto piccole
Emivita molto breve
Scarsa utilità diagnostica
•La risposta di fase acuta si sviluppa in tutte le condizioni
caratterizzate da danno tissutale
Aumento APP è ASPECIFICO
•La risposta di fase acuta varia in funzione della specie
animale
Aumento APP è SPECIE-SPECIFICO
1
PROTEINE DI FASE ACUTA NEGATIVE
Proteine di fase acuta (APP), a cosa
servono?
Funzione di trasporto per colesterolo, retinolo,
T3 e T4, Fe, Hb, Cu, Zn, HDL, LDL
Albumina
•Maggiore “consumatrice” di aminoacidi; se ne viene
prodotta di meno, vengono resi disponibili aminoacidi per
APP positive
Funzione infiammatoria/immunitaria: opsonine,
attivatori del complemento
Funzione di “pulizia”: rimozione detriti cellulari,
neutralizzazione di enzimi proteolitici
Transferrina
(tranne uccelli)
•Trasportatrice di Fe: se diminuisce, cala il Fe
circolante
Albumina e Transferrina hanno emivita lunga. Effetti dell’infiammazione (
Alb e TIBC) visibili
dopo una settimana
PROTEINE DI FASE ACUTA POSITIVE (aumentano)
Cortisol binding globulin (CBP)
Transtiretina(ormoni tiroidei e retinolo)
PROTEINE DI FASE ACUTA NEGATIVE (diminuiscono)
Retinol binding protein (RBP)
se diminuiscono, aumenta la quota di ormoni e vit. A “free”
PROTEINE DI FASE ACUTA POSITIVE
PROTEINE DI FASE ACUTA POSITIVE
“Major”
“Minor”
“Major”
“Minor”
Human
SAA, CRP, LBP
Hp, AGP, Fibrinogeno
Human
SAA, CRP, LBP
Hp, AGP, Fibrinogeno
Dog
CRP, SAA
AGP, Hp, Cp
Dog
CRP, SAA
AGP, Hp, Cp
Cat
SAA, AGP
CRP, Hp, Cp
Cat
SAA, AGP
CRP, Hp, Cp
Horse
SAA, CRP
Hp, Fibrinogeno, AGP
Horse
SAA, CRP
Hp, Fibrinogeno, AGP
Ruminants
Hp
SAA, Cp, a2MG, LBP,AGP, CRP
Swine
MAP, CRP, Hp
SAA, AGP, Cp
Rabbit
SAA, CRP, LBP
a2MG
Mouse
SAA
AGP, LBP, CRP
Chicken
CRP, SAA, AGP
Fibrinogeno, Transferrina
Ruminants
Hp
SAA, Cp, a2MG, LBP,AGP, CRP
Swine
MAP, CRP, Hp
SAA, AGP, Cp
Rabbit
SAA, CRP, LBP
a2MG
Mouse
Chicken
SAA
CRP, SAA, AGP
AGP, LBP, CRP
Fibrinogeno, Transferrina
Ruolo biologico delle APP feline
PROTEINE DI FASE ACUTA POSITIVE
SUDDIVISIBILI IN 3 GRUPPI (per entità dell’aumento):
SIERO AMILOIDE A (SAA)
•A = aumentano del 50% circa:
•Cp, C3, C4
•Trasportata insieme alle HDL
•B = aumentano 2-3 volte:
•Hp, Fibrinogeno, a-globuline antiproteasiche (a1-antitripsina),
2MG, LBP
•Aumento entro 8-10 h, persistente per 24-48 h
di necrosi?
•C = aumentano da 5 a 1000 volte:
•CRP, SAA, Proteine fetali (AGP nel gatto), pigMAP
•Aumento entro 4-5 h, persistente per 24-48 h
•Interviene nella rimozione di residui lipidici (colesterolo) dalle aree
•Lega residui LPS batterici?
•Più isoforme a diverso significato (possibili shift?)
•Inibisce febbre indotta da IL-1 e TNF
•Inibisce reazioni leucocitarie (fagocitosi), ma attiva chemiotassi
•Azioni di immunomodulazione (linfociti e cellule endoteliali)
•Inibizione dell’aggregazione piastrinica
SE LO STIMOLO PERSISTE, L’AUMENTO PERSISTE!!!
•Interviene nel rimodellamento cicatriziale (isoforma 3)
…..ATTENZIONE AL DIGIUNO!
….DIETE IPERPROTEICHE (in particolare negli animali da carne)
2
Ruolo biologico delle APP feline
a1-GLICOPROTEINA ACIDA (AGP, Orosomucoide)
•Famiglia delle lipocaline = lega gruppi idrofobici
•Punto isoelettrico molto basso e alta concentrazione di zuccheri
(45%)
•Proteina di trasporto (farmaci, eparina, istamina, serotonina,
steroidi)
•Inibisce i granulociti neutrofili (chemiotassi, aderenza, digestione)
•Inibisce l’attivazione del complemento e delle chinine
Ruolo biologico delle APP feline
APTOGLOBINA (Hp)
•Lega l’emoglobina libera (può diminuire in corso di emolisi)
•Riduce il danno ossidativo associato ad emolisi
•Azione immunomodulatrice attraverso il legame con le integrine
leucocitarie
•Inibizione dei neutrofili (chemiotassi, fagocitosi, battericidia)
•Può inibire la proliferazione dei mastociti
•L’attività antiinfiammatoria è maggiore nelle forme (iper)sialilate
•Inibisce aggregazione piastrinica
•Interagisce con linfociti T (inibizione)
•Legame con gli LPS neutralizzandone la tossicità
APP nel gatto: come le misuro?
Ampia verietà in letteratura di studi ‘metodologici’
Harvey JW. Feline haptoglobin. Am J Vet Res 39:549-53, 1978
Baker RJ. Valli VE. Electrophoretic and immunoelectrophoretic analysis of feline serum
proteins. Can J Vet Res 52:308-314, 1988
Katnik I. et al., Cross reactivities among some mammalian haptoglobins studied by a
monoclonal antibody. Comp Biochem Physiol. Part B 119:335-40, 1998
Sasaki K. et al., Characterization of monoclonal antibodies specific for feline serum
amyloid (SAA) protein. Hybridoma. 20:103-108, 2001
Bence LM, et al. An immunoturbidimetric assay for rapid quantitative measurement of
feline alpha-1-acid glycoprotein in serum and peritoneal fluid. Vet Clin Pathol. 2005
Dec;34(4):335-41
Hanse AE et al. Evaluation of a commercially available human serum amyloid A (SAA)
turbidimetric Immunoassay for determination of feline SAA concentration.
Vet Res Commun. 2006 Nov;30(8):863-72
Tamamoto T, et al. Verification of measurement of the feline serum amyloid A (SAA)
concentration by human SAA turbidimetric immunoassay and its clinical application.
J Vet Med Sci. 2008 Nov;70(11):1247-52.
3
Utilità degli studi metodologici/analitici
Vantaggi delle metodiche immunoturbidimetriche
automazione, costi minori per il laboratorio e di riflesso per il clinico, tempi inferiori
In mancanza di TIA…
Stockham & Scott: ‘Fundamentals of Veterinary Clinical Pathology’
MISURAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE
DELLE SINGOLE PROTEINE
Elettroforesi delle proteine del siero
Gatto PIOMETRA
ELISA
(SAA)
Gatto FIBROSARCOMA
MISURAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE
DELLE SINGOLE PROTEINE
Immunodiffusione radiale
AGP
Hp, CRP
Metodi colorimetrici
4
…..Sì, ma in pratica?
Valore diagnostico delle APP
Valutazioni ‘qualitative’
WESTERN BLOTTING
202
•Aumento APP = flogosi
•Aumento marcato = flogosi di probabile natura
infettiva (batteri>virus)
115
98
51
•Attenzione alla ‘velocità’:
37
Anticorpo anti SAA
aumentano in poche ore, picco in 1-3 giorni, ‘plateau’ finchè persiste lo stimolo
29
19
6
“FALSI POSITIVI”
SDS page
Marcatura con anticorpi specifici di proteine migrate su gel
“FALSI NEGATIVI”
•Aumentano in gravidanza e postpartum
•Stress
•Fenobarbital induce aumento AGP
nel gatto
•Variabilità individuale (età, razza,
ambiente)
•Campione emolitico: riduzione Hp
•Ridotta specificità?
•Prove immunologiche
•Specie specificità dei tests
Nel Gatto?
Valore diagnostico delle APP: grosso limite di aspecificità
Characterization of the Anemia of Inflammatory Disease in Cats with Abscesses,
Pyothorax, or Fat Necrosis
Mareike Ottenjann, Christiane Weingart, Gisela Arndt Barbara Kohn,
JVIM, march 2006
Altri utilizzi?
PROGNOSI
MONITORAGGIO DELLA PATOLOGIA
MONITORAGGIO DELL’EFFICACIA TERAPEUTICA
Nel Gatto: SAA o AGP?
ABSTRACT
The purpose of this study was to describe the anemia of inflammatory disease (AID) in cats with naturally-occurring
inflammatory diseases, such as abscesses (n = 12), pyothorax (n = 6), and fat necrosis (n = 3). Exclusion criteria
were positive FeLV/FIV tests, neoplasia, nephro-, hepato-or endocrinopathies, and blood loss anemia. CBC, clinical
biochemistry, measurements of serum erythropoietin, iron, total iron-binding capacity (TIBC), ferritin, acute phase
proteins, erythrocytic osmotic fragility (OF), and Coombs' tests were performed. A decrease in hematocrit of 1–28%
(median, 10%) occurred within 3–16 days (median, 8 days). The anemia was mild (n = 11), moderate (n = 8), or
severe (n = 2). In most cases it was normocytic normochromic, non-regenerative (n = 18), or mildly regenerative (n
= 3). Sixteen cats had leukocytosis and 5 mild hyperbilirubinemia. The Coombs' test results were negative for 8
cats and positive for 1 cat. OF was increased in 2 out of 14 cats. Hypoalbuminemia (n = 18) and hyperglobulinemia
(n = 16) resulted in a lowered albumin/globulin-ratio in 19 cats. Iron and TIBC were low in 2/19 and 6/19 cats,
respectively. The ferritin concentrations were normal in 7 cats and increased in 12 cats. The acute phase proteins
α1-acid-glycoprotein and haptoglobin were increased in 14/14 and 13/14 cats, respectively. Erythropoietin was
normal (n = 4), mildly increased (n = 7) or severely increased (1). Two cats were euthanized due to their underlying
disease, 3 cats needed blood transfusions. AID in cats is usually mild to moderate, non-regenerative, and
normocytic normochromic. It can be clinically relevant causing severe and transfusion-dependent anemia. AID
seems to be multifactorial with evidence of iron sequestration, decreased RBC survival, and insufficient
erythropoietin production and bone marrow response. Specific and supportive therapy, including transfusions, can
reverse these processes.
SAA o AGP?
Vet Immunol. Immunopathol. 1999, 68: 91–98
5
SAA o AGP?
Sasaki K. et al., Evaluation of feline serum amyloid A (SAA) as an inflammatory marker. J Vet
Med Sci 65:545-548, 2003
SAA o AGP?
Correa et al.,Serum alpha-1-acid glycoprotein in cats with lymphoma.
JAAHA 37:153-158, 2001
SAA o AGP?
SAA o AGP?
SAA (µg/ml)
80
70
60
50
40
30
90
20
***
C
FE
FIP
80
70
10
0
T0
60
T30
T55
T85
T55
T85
AGP (µg/ml)
50
40
***
30
***
20
10
0
SAA(µg/ml)
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Hp (mg/ml x 10) AGP(µg/ml)
T0
T30
SAA o AGP?
6
SAA o AGP?
SAA o AGP?
Significato delle alterazioni QUALITATIVE
Quando le APP diventano un problema!
Decreased sialylation of the Acute phase protein a1-acid glycoprotein in feline infectious peritonitis
(FIP).
AL = Amyloid Light Chain = catene leggere degli anticorpi (l > k) e/o frammenti NH2
terminali di catene leggere
Ceciliani F, Grossi C, Giordano A, Pocacqua V, Paltrinieri S
AA = Amyloid Associated protein = proteina di 76 amminoacidi (8500 dalton)
derivta da SAA (Serum AA) = proteina della fase acuta presente nel siero
associata ad HDL
Vet. Immunol. Immunopathol. (2004) 99:229-236
ATTR = Amyloid TransThyRetin = proteina di trasporto (trans) di tiroxina (Thy)
e retinolo (Retin): è una prealbumina (uomo, uccelli) o una a2-globulina (altre
specie)
Ab2m = Amyloid b2-microglobulin = proteina di fase acuta associata al
complesso maggiore di istocompatibilità I (MHCI)
Ab = b2amyloid protein = proteina di segnale neuronale derivata da APP (amyloid
precursor protein) presente sulla membrana neuronale
IAPP (Islet Amyloid PolyPeptide) o Amilina = molecola a funzione non del tutto chiara
(gluconeogesnesi? Glicolisi?) cosecreta con l’insulina dalla cellule b del pancreas
PrP (Prion protein) = proteina prionica
Altre proteine “minori” = apolipoproteina I (AI) procalcitonina, cheratina, oncoproteine
Quando le APP diventano un problema!
Quando le APP diventano un problema!
AMILOIDOSI REATTIVA SISTEMICA
AMILOIDOSI EREDO-FAMILIARI
flogosi persistente
IL
-1
,I
L-
6,
T
NF
a
IL-1, IL-6, TNFa
sangue
epatociti
Enzimi
leucocitari
e/o tissutali
SAA
AA
macrofagi
Gatto siamese, abissino, somalo
•alterazione nella struttura (e nella quantità) di SAA circolante
•saturazione dei sistemi proteolitici tissutali
Precipitazione sotto forma di beta fibrille insolubili
Proteolisi e
risoluzione
FORMAZIONE E DEPOSIZIONE
DI β-FIBRILLE (AA)
PROTEOLISI INCOMPLETA
(difetti enzimatici? SAA anomala?)
7
Altre molecole che funzionano come APP nel gatto?
Altre molecole che funzionano come APP nel gatto?
‘ACUTE PHASE REACTANTS’
TOTAL SIALIC ACID (TSA): AN ACUTE PHASE REACTANT IN
CATS WITH A POSSIBLE ROLE IN FELINE CORONAVIRUS
INFECTION
Gabriele ROSSI, DVM
Saverio PALTRINIERI, DVM, PhD, Dipl. ECVCP in press
•Antitrombina
•Acido Sialico
•Mannose binding lectin (?)
•Epcidina (?)
•Omocisteina (?)
•Ghrelina (?)
•Leptina (?)
•………
Riassumendo…
Cenni relativi all’utilizzo clinico delle APP in altre specie
Animali da reddito molto studiati: possibile impatto economico
•APP nel Gatto: mondo solo parzialmente esplorato
CAVALLO: POCHI STUDI
(ANCORA MENO CHE NEL GATTO!)
Stine Jacobsen(Danimarca)
•SAA e AGP hanno un ruolo come marker di flogosi
(utili anche per il monitoraggio di animali malati)
•AGP = marker diagnostico per FIP (e monitoraggio
gatti esposti al FCoV)
•Alterazioni qualitative della struttura proteica
(glicosilazione) possono avere un ruolo importante in
studi patogenetici.
Caratteristiche e uso delle APP nella specie Equina
Messa a punto di TIA nel cavallo e
studi clinico-patologici
APP più importanti:
•Fibrinogeno: aumenta di poco e lentamente
•SAA
•Malattie infettive
(herpes virus, Rhodococcus, influenza..),
•Sepsi neonatale
•Malattie parassitarie
•Artriti
•Post-chirurgia
•Laminiti
•Coliche
Ruolo delle APP
nell’allevamento bovino
Aumento delle APP pare essere maggiore nelle forme infettive
(Batteriche>Virali)
Influenza lieve di età e sesso sulla concentrazione delle APP
Nei neonati differenze a seconda dei giorni di età e del tipo di parto
SAA marker di setticemia neonatale
(e utilizzato nel monitoraggio della risposta alla terapia antibiotica)
SAA anche produzione extraepatica: studi su espressione a livello articolare
in corso di zoppie
SAA misurazioni a livello di liquido peritoneale in corso di coliche: utilizzo prognostico
SAA aumenta anche durante BVD (Muller-Doblies et al., Clin Diag Lab Immunol 11:302, 2004)
anche se poco specifica (Ganheim et al., J Vet Med B 50:183, 2003)
Forme batteriche: aumenti in corso di Pastorellosi (Hodgson, 5°° APP multicolloquium, 2005)
Aumenti SAA e AGP in corso di Theileriosi (Glass et al., Int J Parasitol, 35:337, 2005)
Aumenti di SAA e Hp anche in dictyocaulosi (alto PPV, basso NPV) (Ganheim et al., Acta Vet
Scand 45:79, 2004)
8
Ruolo delle APP nell’allevamento bovino
Ruolo delle APP nell’allevamento bovino
Hp (ma non le altre APP) utili per identificare forme respiratorie
multifattoriali precoci (Carter et al., Am J Vet Res 63:1111, 2002)
Horadagoda et al., Vet Rec 144:437,
1999
Infiammazioni sistemiche
sens
spec
Hp
70%
76%
SAA
100% 90%
PMN 71%
30%
band 42%
72%
SAA come selezione pre-macellazione? (Karreman et al., Vet Quart 22:175, 2000)
Ruolo delle APP nell’allevamento bovino
Ruolo delle APP nell’allevamento bovino
•Relazione Hp – stress (Slocombe & Holditz, 2005)
Ruolo delle APP nelle produzioni suine
Ruolo delle APP nelle produzioni suine
Ruolo delle APP nelle produzioni suine
GESTIONE
•APP più alte in allevamenti con:
•Accesso libero visitatori
•Ciclo continuo
•Alta densità di animali
•APP più alte dopo trasporti lunghi ma anche dopo trasporto al macello
•Stressors gestionali:
•“mixing” aumenta APP, soprattutto nei maschi (influenzata anche la crescita)
•Alimentazione ristretta aumenta APP (e diminuisce incremento ponderale)
•Hp e AGP aumentano in suini con mastite-metrite-agalassia già al primo giorno
(van Gelder e Bilkei, Tijdschrift voor Diergeneeskunde. 130:38, 2005)
•SAA e Hp aumentano in suini con mastide indotta da Coli già al primo giorno (Zhu
et al., Am J Vet Res 65:1434, 2004)
•SAA e Hp aumentano 20h dopo infezione con Actinobacillus pleuropneumoniae
(anticorpi = 7-10 giorni) (Hulten et al., Vet Micr. 95:75, 2003)
STATO SANITARIO
In allevamento
•Relazione inversa tra stato igienico e Hp
•APP alte in suini che ricevono trattamenti superiori a 1.15€
•APP elevate in seguito a trattamenti antibiotici auxinici
•APP basse in suini che hanno aumenti di peso maggiori
•APP più alte in gruppi con maggiore prevalenza di malattie
•Aumenti Hp in corso di peste suina africana (Carpintero et al., 2005)
•APR (aumenti SAA, Hp, PigMAP, cali ApoA1) in streptococcosi sperimentali
(Sorensen et al.,, 2005)
Al macello
•APP più alte in suini con lesioni al macello più estese
•APP non correlate a lesioni che non declassano le carni
9
Riassumendo…
•APP = indicatori di infiammazione precoci e potenti
•Utilizzo in diagnostica di allevamento supportato da riscontri
sperimentali e di campo
•Hp, SAA (MAA), AGP nel bovino (mastiti)
•Hp, PigMAP, AGP, CRP nel suino
•Utilizzo nella gestione dell’allevamento sia a scopi preventivi che
“produttivi”
•Utilizzo in sede di macellazione per evidenziare forme
latenti/pregresse/trattate
10
