Adele Mossa_Progetto di Ricerca

Progetto di Ricerca di Adele Mossa
BANDO N. 061.003.BS.01/2013
Caratterizzazione di neuroni ottenuti dal differenziamento di cellule iPS di pazienti affetti da
malattia di Alzheimer
Il progetto ha i seguenti obiettivi e scopi:
Obiettivo 1: raccolta e riprogrammazione di fibroblasti sia da pazienti con AD familiare con
acclarata causa genetica e da individui sani di età corrispondente a quella dei pazienti.
Con questo obiettivo ci proponiamo di ottenere e riprogrammare fibroblasti da pazienti con AD e da
individui sani di medesima età.
Scopo 1.1 - Raccolta di fibroblasti da pazienti affetti da Alzheimer familiare.
Al fine di utilizzare la tecnologia dell cellule iPS per i casi di AD familiare, abbiamo cercato
fibroblasti ottenuti da individui adulti con mutazioni accertate.
Metodologia per questo scopo: gli individui che parteciperanno saranno informati degli obiettivi
della ricerca e firmeranno il consenso prima di essere coinvolti nello studio. Le linee di fibroblasti
sia degli individui sani che di quelli malati verranno riprogrammati parallelamente. Fibroblasti
primari di cute verranno ottenuti da biopsie. Le biopsie verranno prima dissociate meccanicamente
e poi saranno fatte crescere in terreno DMEM supplementato con il 10% di FBS. Le colture si
formeranno in 7-14 giorni.
Scopo 1.2 - Riprogrammazione di fibroblasti
La riprogrammazione dei fibroblasti avverrà utilizzando i tradizionali VSVG coated retrovirus per
ciascuno dei quattro geni necessari alla riprogrammazione (Oct4, Klf4, Sox2 e Myc).
L’intero processo di riprogrammazione, al termine del quale si ottengono cloni primari dura circa 78 settimane, trascorse le quali raccoglieremo circa 10-20 cloni per ciascuna riprogrammazione
in modo da ottenere circa 2 linee di iPS per ogni linea cellulare di fibroblasti inclusa nello studio.
Per selezionare le migliori colture riprogrammate inizialmente ci baseremo sull’osservazione della
morfologia dei cloni. Successivamente eseguiremo sulle colture immunofluorescenza per i
principali marcatori di pluripotenza come Nanog e AP, in quanto l’immunoreattività a questi
marcatori rappresenta un buon segnale di acquisizione di pluripotenza.
Infine, dato che alcuni dei fibroblasti che verranno utilizzati in questo progetto saranno ottenuti da
individui anziani, valuteremo la possibilità di seguire nuovi protocolli descritti per ringiovanire i
fibroblasti umani che usano due geni aggiuntivi al cocktail di riprogrammazione, ossia Nanog e
Lin-28. Successivamente verrà eseguita una caratterizazione approfondita di tutte le colture
ottenute, attraverso: i) analisi del cariotipo, ii) controllo in tutte le colture dell’effettivo
silenziamento dei geni esogeni virali, iii) differenziamento in vitro nei tipi cellulari di tutte le linee
germinali, in particolare, cellule dell’endoderma (Sox-17+), cellule del mesoderma (SMA+) e
cellule del neuro ectoderma (TuJ1+), iv) valutazione della capacità da parte delle cellule di dare
origine ad un teratoma se iniettate sottocute in un topo nudo. Solo le linee cellulari di iPS che
presenteranno tutte queste caratteristiche verranno usate per la riprogrammazione completa e per i
successivi studi.
Risultati attesi da questo lavoro: ci aspettiamo di ottenere un numero sufficiente di fibroblasti sia
da pazienti affetti da AD familiare che da donatori sani di medesima età, sesso e razza.
Obiettivo 2: ottimizzare la differenziazione delle iPS in neuroni eccitatori ed inibitori,
caratterizzare le differenze di espressione nei marcatori sinaptici, i parametri funzionali
elettrofisiologici ed i profili di espressione genica.
Progetto di Ricerca di Adele Mossa
BANDO N. 061.003.BS.01/2013
Con questo scopo ci proponiamo di indurre e caratterizzare la differenziazione neuronale delle
cellule iPSC. Le colture di iPS proliferanti saranno indotte verso un destino neuronale seguendo un
protocollo messo a punto in questa Unità. Saranno studiate alterazioni sinaptiche morfologiche e
funzionali in neuroni derivanti da pazienti AD.
Scopo 2.1 - Ottimizzare la differenziazione delle iPS in neuroni eccitatori ed inibitori. Quando
cellule pluripotenti riprogrammate saranno disponibili per i pazienti e per gli individui controllo, ci
proponiamo di indurre la loro differenziazione neuronale in vitro utilizzando un protocollo già
messo a punto nell’unità Sala anche in collaborazione con il laboratorio Boecker.
Brevemente, le colonie di iPS saranno raccolte in larghi aggregati e fatte crescere come in
sospensione in piastre da coltura per cellule non aderenti per indurre i corpi embrionali (EBs) per 4
giorni. Saranno indotti i EBs in piastre di 10 cm in terreno di differenziamento contenente 10% SR
senza bFGF. Dopo questo, i EBs saranno piastrati in multiwell da 6 pozzetti rivestite di matrigel e
messe in coltura in terreno basale ITSF per ulteriori 5 giorni. Dopo questo periodo appariranno, in
ciascuna EB piastrata, rosette multiple neuronali indicando l’induzione di un destino neuronale.
Come passo successivo, le rosette saranno piccate manualmente e disgregate in singole cellule,
prima di piastrarle su vetrini rivestiti di matrigel per la differenziazione finale in terreno neurobasal
contenente N2, B27, acido ascorbico e BDNF. Quest’ultimo processo potrebbe durare anche 8-10
settimane per permettere una sostenuta differenziazione neuronale e la successiva maturazione.
Dopo quest’ultimo passaggio, riusciremo studiare lo sviluppo di una morfologia neuronale matura
con un albero dendritico e la formazione di contatti sinaptici come riveleremo mediante
immunostaining per marcatori dei compartimenti pre- e post-sinaptici. Per sostenere maggiormente
la sopravvivenza delle colture neuronali derivanti da iPS, utilizzeremo delle co-colture tra cellule
neuronali derivanti da iPS con uno strato di astrociti murini per aumentare l’aderenza cellulare ed il
rilascio di stimoli di sopravvivenza. Ciò dovrebbe consentire un mantenimento a lungo termine
della coltura differenziata e facilitare una loro ulteriore maturazione e acquisizione delle
caratteristiche capacità funzionali. Il protocollo per il differenziamento neuronale delle iPS è stato
sviluppato dalla Unità Sala, e sarà condiviso con gli altri partner che contribuiranno alle analisi
funzionali dei neuroni derivanti dalle iPS, come descritto di seguito.
Risultati attesi per questo obiettivo: ci aspettiamo di impostare completamente e di caratterizzare
lo sviluppo neuronale dei neuroni derivati da cellule iPS di pazienti e donatori sani di età
comparabile.
Scopo 2.2 – Caratterizzazione della differenza di espressione di marcatori sinaptici e parametri
funzionali elettrofisiologici. Le colture neuronali derivate da iPS saranno accuratamente
caratterizzate per l'espressione di marcatori sinaptici e per parametri funzionali elettrofisiologici. In
particolare, verranno effettuati esperimenti di immunofluorescenza su neuroni derivati da pazienti e
da controlli per evidenziare le proteine delle sinapsi eccitatorie e inibitorie sinaptofisina, VGLUT,
VGAT, PSD-95, Homer, AMPA e per le principali subunità dei recettori NMDA, la famiglia delle
proteine Shank e Gefrina. La funzionalità sinaptica sarà testata anche valutando lo stato di
fosforilazione di ERK1/2 indotta da NMDA e la stimolazione dei recettori mGluR o dalla
depolarizzazione indotta da KCl. Quantificheremo il numero delle puncta immunofluorescenti
(sinapsi) per una determinata lunghezza del dendrite e l’intensità del segnale di
immunofluorescenza di ogni puncta. Con i dati così ottenuti potremo quindi valutare i cambiamenti
globali nella quantità sinaptica ma anche cambiamenti nella distribuzione delle proteine tra le
sinapsi. Questa procedura sarà disponibile a tutti i partner coinvolti nella caratterizzazione
molecolare della patogenesi AD. Inoltre, le proprietà elettrofisiologiche di questi neuroni derivati da
iPS saranno studiati misurando mEPSCs e mIPSCs in singole cellule. Tutti questi protocolli, che
sono stati ampiamente utilizzati dai partner per lo studio di colture neuronali primarie di topo e
ratto, saranno ottimizzati per i neuroni derivati da iPS.
Progetto di Ricerca di Adele Mossa
BANDO N. 061.003.BS.01/2013
Risultati attesi per questo obiettivo: ci aspettiamo di caratterizzare completamente lo sviluppo
delle sinapsi neuronali, la struttura e la funzione dei neuroni derivati da iPS di pazienti, e di donatori
sani di età comparabile.
Scopo 2.3 – Profilo dell’espressione genica globale di IPSC e neuroni derivati da IPSC. Indagini di
espressione genica verranno eseguite su IPS iniziali e linee di cellule neuronali derivate da iPS di
pazienti AD e controlli sani. Questo permetterà di confrontare il profilo di espressione di iPS
originarie rispetto a linee cellulari neuronali derivanti da iPS e di ottenere un profilo di espressione
comune corrispondente al differenziamento neuronale in-vitro da iPS. Studieremo la
differenziazione delle iPS da 3 pazienti con AD e 3 controlli sani indipendenti. Per ogni individuo
genereremo almeno 3 campioni di RNA rispettivamente corrispondenti uno alle IPS originarie e due
indipendenti colture di cellule neuronali derivate; ogni esperimento di microarray sarà replicato due
volte. Questi esperimenti saranno fatti in collaborazione con l'unità di Canonico.
Risultati attesi per questo obiettivo: ci aspettiamo di caratterizzare in modo completo il profilo di
espressione genica delle iPSC e dei neuroni-iPSC ottenuti da pazienti e da donatori sani della stessa
età.