Cellulestaminalinellosviluppoe
nellamalattiadelmuscoloscheletrico
SilviaBrunelli
17marzo2017
Ilmuscoloscheletrico
Fasciodifibremuscolari
Sezionelongitudinale
Sezionetrasversale
Ilsarcomero
Comesi formail muscolo
LaMiogenesi èletteralmente il processo diformazione dei muscoli
Progenitore
cellulastaminalemuscolare
Mioblasto
Cellula staminale
Progenitore
Cellule
differenziate
Determinazione
Moltiplicazione
Miocita
Allineamento
Nonc’èpiùproliferazione
Miotubo
Fusione
Differenziamento
Miofibra
Maturazionee
contrazione
Quandosiformanoimuscoliele
cellulechelicompongono?
Topo
Uomo
Itrefogliettiembrionali
Topo
8.5-9giorni
4-5settimane
Uomo
Tuttiimuscolioriginanonell’embrionedastrutture
mesodermichechiamatesomiti
Embrioneditopo9.5giornidopoilconcepimento
somite
Tuboneurale
Bande compatte dicellulemesodermiche ai lati deltubo neurale
Mesoderma nonsegmentato
Sisepara inblocchi dicellule(somiti)
Sviluppoecrescitadeimuscoli
Muscolidellaschiena
Miotomo
epassiale
Miotomo
ipassiale
Tubo
digerente
Muscolidella
cassatoracica
Cavità
viscerale
Muscoli
intercostali
Lapotenzialità delle cellulestaminali
Unipotente
Multipotente
Lapotenzialità delle cellulestaminali muscolari
Lacellula staminale muscolare è unipotente
Cellulastaminalemuscolare
Progenitoremuscolare
Miotubo
Mioblasto che
proliferae
differenzia
Lamiogenesi è unprocesso asincrono:adiversi stadi embrionali e
nell’adulto fibre ditipo diverso sono formate dacelluleprogenitrici e
staminali ditipo diverso.
Embrione
Celluledelsomite
Progenitoriemioblasti
embrionali
Fibreprimarie
Progenitoriemioblasti
Fetali
Fibresecondarie
La miogenesi, accrescimento e riparo nell’adulto sono a carico
delle cellule satelliti.
Embrione
Adulto
Celluledelsomite
Progenitoriemioblasti
embrionali
Fibreprimarie
Progenitoriemioblasti
Fetali
Fibresecondarie
Cellulesatelliti
FibreadulteeRiparazione
La cellula satellite
Le cellule satelliti sono piccole cellule che si trovano nella parte
esterna della fibra muscolare
Contribuisco all’accrescimento postnatale del muscolo ma nell’adulto
rimangono quiescenti fin quando non si attivano in seguito a un
trauma
Ilprocessodirigenerazionemuscolare
In response to stimuli such as myotrauma or exercise, satellite cells
become activated, proliferate, and express myogenic markers.
Solocellulesatelliti?
In response to stimuli such as myotrauma or exercise, satellite cells
become activated, proliferate, and express myogenic markers.
Altrecellulecon
potenzialemiogenico?
Ultimately such myoblasts fuse to existing muscle fibres or fuse together
to form new young muscle cells, the myotubes.
Myotubes undergo further differentiation and mature to form fully
functional muscle fibres.
Embrione
Adulto
Celluledelsomite
Progenitoriemioblasti
embrionali
Fibreprimarie
cellulestaminali
associateaivasi
sanguigni
Progenitoriemioblasti
Fetali
Fibresecondarie
Cellulesatelliti
FibreadulteeRiparazione
Imesoangioblasti,cellulestaminali multipotenti associateai
vasi,contribuiscono alla miogenesi invivosia nell’embrione….
Azzoni etal.,2014
…sia nell’adulto
Dellavalle etal.,2011
Diversi segnali cambiano il destino eil differenziamento
delle cellulestaminali multipotenti invitro
Miotubo scheletrico
Citochine
Fattori dicrescita
Cellulamuscolareliscia
Cellulamuscolarecardiaca
Proteine di
rivestimento
Osteocita
Cellulastaminale
Condrocita
Adipocita
Celluladelsangue
Azzoni etal.,2014
Riparo muscolare completo
Reclutamento e
differenziamento di
cellulestaminali
miogeniche
Produzione dicitochine
efattori dicrescita
Rimozione delle cellulemorte
Danno muscolare otrauma
acuto
infiammazione
Quando una fibra muscolare si contrae lasua membrana deve
accorciarsi,madeve rimanere ancorata alle membranedelle altre
fibre ealla componente cellulare interna
Semanca l’ancoraggio aumenta laprobabilità diundanno
durante lacontrazione conconseguente morte delle fibre
muscolari
Cicatrizzazione del
tessuto eaccumolo
digrasso
Riparo muscolare completo
Progressivo esaurimento dicellulestaminali
muscolari eproliferazione difibroblasti
Reclutamento e
differenziamento di
cellulestaminali
miogeniche
Produzione dicitochine
efattori dicrescita
Danno muscolare otrauma
Riparo parziale
Rimozione delle cellulemorte
acuto
infiammazione
cronico
infiammazione
Proteineresponsabilidell’integritàdellamembranadellafibra
muscolare
Distrofia muscolare
Manifestazione
Duchenne/
Becker
Emery-Dreifuss,
Congenital
Limb-Girdle,
Distal Myopathy
2-6 anni
Infanzia
Da infanzia a adulto
variabile
Adulto
X-linked recessiva
(si ammalano sono
im maschi)
X-linked recessiva,
autosomica dom &
rec.
Autosomica
dominante &
recessiva
Distrofina
Emerina, lamina,
merosin
Calpain-3, Dysferlin,
Caveolin-3, αbdgsargoglycans, etc.
Muscoli affetti
Aspettativa di Raramente oltre i 20
vita
anni
Ereditarietà
Proteina
mutata
Source: www.mdausa.org
Mutazioni nel gene della DISTROFINA
DISTROFIA MUSCOLARE di DUCHENNE
1 su 3500 nati maschi
Mediamente l'aspettativa di vita non è superiore ai 20
anni, dai 10 in carrozzina, con ventilazione notturna.
Non esiste terapia farmacologica risolutiva
Comesipuòvisualizzareladistrofina intornoallefibremuscolariin
sezione
Normale
PazienteDMD
Distrofia:progressivodannoaltessutomuscolare
Faseprecoce:
ilmuscolotentadi
ripararsi,malenuove
fibresonosempre
difettoseperchéhanno
semprelastessa
mutazione
FaseTardiva:
ilmuscoloesauriscele
cellulestaminali,eil
tessutomuscolareè
sostituitodaunacicatricee
dagrassoeperde
funzionalità
Macrofagiche
eliminanoidetriti
efibremorte
Miofibra
Mioblasti che
cercanodi
riparare
StrategieditrattamentoecuraperlaDMDealtreDistrofie:
situazioneattualeeprospettive
TerapiaGenica:
Ilgenedelladistrofina èmoltolungo(25000bp),nonèancora
tecnicamentepossibiletrasferirlotutto
TerapiaCellulare:
Qualicellulestaminali?
StrategieFarmacologiche
• Gluococorticoidi (steroidi)
• Fattoridicrescita(IGF1)
• Inibitori TNF-a
• OssidoNitrico
• Inibitoridellamiostatina
• NucleicAcidDrugs
Tuttiquestitrattamentisonopalliativi
ritardanodipocoilpeggioramentodellapatologia
StrategieditrattamentoecuraperlaDMDealtreDistrofie:
situazioneattualeeprospettive
TerapiaGenica:
Ilgenedelladistrofina èmoltolungo(25000bp),nonèancora
tecnicamentepossibiletrasferirlotutto
TerapiaCellulare:
Qualicellulestaminali?
StrategieFarmacologiche
• Gluococorticoidi (steroidi)
• Fattoridicrescita(IGF1)
• InibitoriTNF-a
• OssidoNitrico
• Inibitoridellamiostatina
• NucleicAcidDrugs
Tuttiquestitrattamentisonopalliativi
ritardanodipocoilpeggioramentodellapatologia
Proprietà ideali delle cellulestaminali
perlaterapia cellulare
• Provenienza:lecelluledevono risiedere nel tessuto ed essere
facilemente recuperabile mediante biopsia
• Crescita:lecelluledevono poter essere mantenute incoltura e
crescere ingrande numero
• Somministrazione emigrazione :peravere una distribiuzione
adeguata dicellulenel muscolo ospite lecelluledevono poter
essere iniettate incircolo ed essere capaci diextravasare e
raggiungere il muscolo
• Differenziamento:una volta raggunto il muscolo devono
differenziare efficientemente.
Possibilistrategieperfutureterapie
cellularidelledistrofiemuscolari
Problemi
Eterologo
Vantaggi
Cellulestaminali
dadonatore
compatibile
Nonserve
Terapia
genica
Immuno-soppressione
otollerizzazione
Autologo
Celluledausare
Cellulestaminali
Isolatidalpaziente
Nonserve
Immunosoppressione
Uso divettori virali
Cellule staminali per il riparo delle distrofie
Cellule miogeniche
isolate dal paziente
Espansione
in vitro
Correzione
della mutazione
Selezione
delle
cellule
Fibre ancora
mutate senza
distrofina
Fibre riparate
Iniezione
delle cellule
Cellule sane
selezionate da
donatori ed
espanse
Lecellulesatelliti perlaterapia cellulare?
• Sono levere cellulestaminali miogeniche
ma:
– Noncrescono facilmente incoltura
– Nonattraversano i vasi
Celluleusate perprotocolli sperimentali terapia
cellulare della DMD
Cellula
Derivazione
Crescita in
vitro
Migrazione
al muscolo
per via
sistemica
HSC (SP)
Midollo osseo
limitata
sì
MAPC
Midollo osseo
sì
-
Mesenchymal
(MSC)
Midollo osseo
sì
sì
Muscle derived
progenitors
Muscolo
sì
modesta
Mesoangioblasti
Piccoli vasi
sì
sì
Da piccoli vasi di muscolo adulto di diverse organismo
si possono isolare mesoangioblasti che in cultura
differenziano in muscolo scheletrico
Uomo
Topo
Cane
Mutazioni nel genedella DISTROFINA
BambiniconDISTROFIAdiDUCHENNE
1su3500natimaschi
Mediamentel'aspettativadivitanonèsuperioreai20anni,
dai10incarrozzina,conventilazionenotturna.
Topo mdxoa-SG
Iltrattamento concellulestaminale migliora lamorfologia
delmuscolo dei topi distrofici
I.F.
laminin
H&E
CTR
CTR
a SG KO
treated
a-SG KO
a-SG KO
treated
CTR
a-SGKO
treated
treated
treated
A.M.
Itopi trattati mantengono anche una buona mobilità
Speed of
contraction
does not
change
Fiber diameter
variation is
reduced
Total number of
fibers approaches
control
Mutazioni nel gene della DISTROFINA
Bambini con DISTROFIA di DUCHENNE
1 su 3500 nati maschi
GRMD
Dystrophin
GRMD
Human control
Canine control
Mediamente l'aspettativa di vita non è superiore ai 20
anni, dai 10 in carrozzina, con ventilazione notturna.
Cane Distrofico GRMD
Anche nel modello canino l’analisi su biopsie muscolari evidenza un
miglioramento quando sono somministrate cellulestaminali
=Laminin
=Dystrophin
= nucleo
https://www.clinicaltrialsregister.eu/ctr-search/trial/2011-000176-33/IT
Conclusionieprospettive
o Il muscolo contiene diversi tipi di cellule staminali che contribuiscono al suo
sviluppo e alla rigenerazione dopo un danno
o Nelle distrofie muscolari il processo di rigenerazione è compromesso
o Diversi protocolli sperimentali su animali modello di distrofia hanno
dimostrato che la somministrazione di cellule staminali migliora la
morfologia e la funzionalità del muscolo
o Sono in corso trial clinici con cellule staminali in pazienti con Distrofia
Muscolare di Duchenne: al momento questi studi hanno dimostrato che il
trapianto è una procedura relativamente sicura anche se per arrivare
realmente ad una cura è necessaria l’ottimizzazione di diversi parametri
quali:
• Modalità di somministrazione delle cellule (quantità e frequenza)
• Età di inizio della somministrazione
• Combinazione con altri farmaci che migliorano il reclutamento delle
cellule e il loro differenziamento miogenico
• Combinazione con terapia genica e uso di nuove tecnologie (es. CRISPRCAS9 )
Gene editing in vivo o ex vivo: dalla fantascienza alla realtà?
Cell Stem Cell7 April 2016,
Vol.18(4):533–
540, doi:10.1016/j.stem.2016.01.021
Short Article
A Single CRISPR-Cas9 Deletion
Strategy that Targets the Majority
of DMD Patients Restores
Dystrophin Function in hiPSCDerived Muscle Cells
