presentazione in pdf
annuncio pubblicitario
Cellulestaminalinellosviluppoe nellamalattiadelmuscoloscheletrico SilviaBrunelli 17marzo2017 Ilmuscoloscheletrico Fasciodifibremuscolari Sezionelongitudinale Sezionetrasversale Ilsarcomero Comesi formail muscolo LaMiogenesi èletteralmente il processo diformazione dei muscoli Progenitore cellulastaminalemuscolare Mioblasto Cellula staminale Progenitore Cellule differenziate Determinazione Moltiplicazione Miocita Allineamento Nonc’èpiùproliferazione Miotubo Fusione Differenziamento Miofibra Maturazionee contrazione Quandosiformanoimuscoliele cellulechelicompongono? Topo Uomo Itrefogliettiembrionali Topo 8.5-9giorni 4-5settimane Uomo Tuttiimuscolioriginanonell’embrionedastrutture mesodermichechiamatesomiti Embrioneditopo9.5giornidopoilconcepimento somite Tuboneurale Bande compatte dicellulemesodermiche ai lati deltubo neurale Mesoderma nonsegmentato Sisepara inblocchi dicellule(somiti) Sviluppoecrescitadeimuscoli Muscolidellaschiena Miotomo epassiale Miotomo ipassiale Tubo digerente Muscolidella cassatoracica Cavità viscerale Muscoli intercostali Lapotenzialità delle cellulestaminali Unipotente Multipotente Lapotenzialità delle cellulestaminali muscolari Lacellula staminale muscolare è unipotente Cellulastaminalemuscolare Progenitoremuscolare Miotubo Mioblasto che proliferae differenzia Lamiogenesi è unprocesso asincrono:adiversi stadi embrionali e nell’adulto fibre ditipo diverso sono formate dacelluleprogenitrici e staminali ditipo diverso. Embrione Celluledelsomite Progenitoriemioblasti embrionali Fibreprimarie Progenitoriemioblasti Fetali Fibresecondarie La miogenesi, accrescimento e riparo nell’adulto sono a carico delle cellule satelliti. Embrione Adulto Celluledelsomite Progenitoriemioblasti embrionali Fibreprimarie Progenitoriemioblasti Fetali Fibresecondarie Cellulesatelliti FibreadulteeRiparazione La cellula satellite Le cellule satelliti sono piccole cellule che si trovano nella parte esterna della fibra muscolare Contribuisco all’accrescimento postnatale del muscolo ma nell’adulto rimangono quiescenti fin quando non si attivano in seguito a un trauma Ilprocessodirigenerazionemuscolare In response to stimuli such as myotrauma or exercise, satellite cells become activated, proliferate, and express myogenic markers. Solocellulesatelliti? In response to stimuli such as myotrauma or exercise, satellite cells become activated, proliferate, and express myogenic markers. Altrecellulecon potenzialemiogenico? Ultimately such myoblasts fuse to existing muscle fibres or fuse together to form new young muscle cells, the myotubes. Myotubes undergo further differentiation and mature to form fully functional muscle fibres. Embrione Adulto Celluledelsomite Progenitoriemioblasti embrionali Fibreprimarie cellulestaminali associateaivasi sanguigni Progenitoriemioblasti Fetali Fibresecondarie Cellulesatelliti FibreadulteeRiparazione Imesoangioblasti,cellulestaminali multipotenti associateai vasi,contribuiscono alla miogenesi invivosia nell’embrione…. Azzoni etal.,2014 …sia nell’adulto Dellavalle etal.,2011 Diversi segnali cambiano il destino eil differenziamento delle cellulestaminali multipotenti invitro Miotubo scheletrico Citochine Fattori dicrescita Cellulamuscolareliscia Cellulamuscolarecardiaca Proteine di rivestimento Osteocita Cellulastaminale Condrocita Adipocita Celluladelsangue Azzoni etal.,2014 Riparo muscolare completo Reclutamento e differenziamento di cellulestaminali miogeniche Produzione dicitochine efattori dicrescita Rimozione delle cellulemorte Danno muscolare otrauma acuto infiammazione Quando una fibra muscolare si contrae lasua membrana deve accorciarsi,madeve rimanere ancorata alle membranedelle altre fibre ealla componente cellulare interna Semanca l’ancoraggio aumenta laprobabilità diundanno durante lacontrazione conconseguente morte delle fibre muscolari Cicatrizzazione del tessuto eaccumolo digrasso Riparo muscolare completo Progressivo esaurimento dicellulestaminali muscolari eproliferazione difibroblasti Reclutamento e differenziamento di cellulestaminali miogeniche Produzione dicitochine efattori dicrescita Danno muscolare otrauma Riparo parziale Rimozione delle cellulemorte acuto infiammazione cronico infiammazione Proteineresponsabilidell’integritàdellamembranadellafibra muscolare Distrofia muscolare Manifestazione Duchenne/ Becker Emery-Dreifuss, Congenital Limb-Girdle, Distal Myopathy 2-6 anni Infanzia Da infanzia a adulto variabile Adulto X-linked recessiva (si ammalano sono im maschi) X-linked recessiva, autosomica dom & rec. Autosomica dominante & recessiva Distrofina Emerina, lamina, merosin Calpain-3, Dysferlin, Caveolin-3, αbdgsargoglycans, etc. Muscoli affetti Aspettativa di Raramente oltre i 20 vita anni Ereditarietà Proteina mutata Source: www.mdausa.org Mutazioni nel gene della DISTROFINA DISTROFIA MUSCOLARE di DUCHENNE 1 su 3500 nati maschi Mediamente l'aspettativa di vita non è superiore ai 20 anni, dai 10 in carrozzina, con ventilazione notturna. Non esiste terapia farmacologica risolutiva Comesipuòvisualizzareladistrofina intornoallefibremuscolariin sezione Normale PazienteDMD Distrofia:progressivodannoaltessutomuscolare Faseprecoce: ilmuscolotentadi ripararsi,malenuove fibresonosempre difettoseperchéhanno semprelastessa mutazione FaseTardiva: ilmuscoloesauriscele cellulestaminali,eil tessutomuscolareè sostituitodaunacicatricee dagrassoeperde funzionalità Macrofagiche eliminanoidetriti efibremorte Miofibra Mioblasti che cercanodi riparare StrategieditrattamentoecuraperlaDMDealtreDistrofie: situazioneattualeeprospettive TerapiaGenica: Ilgenedelladistrofina èmoltolungo(25000bp),nonèancora tecnicamentepossibiletrasferirlotutto TerapiaCellulare: Qualicellulestaminali? StrategieFarmacologiche • Gluococorticoidi (steroidi) • Fattoridicrescita(IGF1) • Inibitori TNF-a • OssidoNitrico • Inibitoridellamiostatina • NucleicAcidDrugs Tuttiquestitrattamentisonopalliativi ritardanodipocoilpeggioramentodellapatologia StrategieditrattamentoecuraperlaDMDealtreDistrofie: situazioneattualeeprospettive TerapiaGenica: Ilgenedelladistrofina èmoltolungo(25000bp),nonèancora tecnicamentepossibiletrasferirlotutto TerapiaCellulare: Qualicellulestaminali? StrategieFarmacologiche • Gluococorticoidi (steroidi) • Fattoridicrescita(IGF1) • InibitoriTNF-a • OssidoNitrico • Inibitoridellamiostatina • NucleicAcidDrugs Tuttiquestitrattamentisonopalliativi ritardanodipocoilpeggioramentodellapatologia Proprietà ideali delle cellulestaminali perlaterapia cellulare • Provenienza:lecelluledevono risiedere nel tessuto ed essere facilemente recuperabile mediante biopsia • Crescita:lecelluledevono poter essere mantenute incoltura e crescere ingrande numero • Somministrazione emigrazione :peravere una distribiuzione adeguata dicellulenel muscolo ospite lecelluledevono poter essere iniettate incircolo ed essere capaci diextravasare e raggiungere il muscolo • Differenziamento:una volta raggunto il muscolo devono differenziare efficientemente. Possibilistrategieperfutureterapie cellularidelledistrofiemuscolari Problemi Eterologo Vantaggi Cellulestaminali dadonatore compatibile Nonserve Terapia genica Immuno-soppressione otollerizzazione Autologo Celluledausare Cellulestaminali Isolatidalpaziente Nonserve Immunosoppressione Uso divettori virali Cellule staminali per il riparo delle distrofie Cellule miogeniche isolate dal paziente Espansione in vitro Correzione della mutazione Selezione delle cellule Fibre ancora mutate senza distrofina Fibre riparate Iniezione delle cellule Cellule sane selezionate da donatori ed espanse Lecellulesatelliti perlaterapia cellulare? • Sono levere cellulestaminali miogeniche ma: – Noncrescono facilmente incoltura – Nonattraversano i vasi Celluleusate perprotocolli sperimentali terapia cellulare della DMD Cellula Derivazione Crescita in vitro Migrazione al muscolo per via sistemica HSC (SP) Midollo osseo limitata sì MAPC Midollo osseo sì - Mesenchymal (MSC) Midollo osseo sì sì Muscle derived progenitors Muscolo sì modesta Mesoangioblasti Piccoli vasi sì sì Da piccoli vasi di muscolo adulto di diverse organismo si possono isolare mesoangioblasti che in cultura differenziano in muscolo scheletrico Uomo Topo Cane Mutazioni nel genedella DISTROFINA BambiniconDISTROFIAdiDUCHENNE 1su3500natimaschi Mediamentel'aspettativadivitanonèsuperioreai20anni, dai10incarrozzina,conventilazionenotturna. Topo mdxoa-SG Iltrattamento concellulestaminale migliora lamorfologia delmuscolo dei topi distrofici I.F. laminin H&E CTR CTR a SG KO treated a-SG KO a-SG KO treated CTR a-SGKO treated treated treated A.M. Itopi trattati mantengono anche una buona mobilità Speed of contraction does not change Fiber diameter variation is reduced Total number of fibers approaches control Mutazioni nel gene della DISTROFINA Bambini con DISTROFIA di DUCHENNE 1 su 3500 nati maschi GRMD Dystrophin GRMD Human control Canine control Mediamente l'aspettativa di vita non è superiore ai 20 anni, dai 10 in carrozzina, con ventilazione notturna. Cane Distrofico GRMD Anche nel modello canino l’analisi su biopsie muscolari evidenza un miglioramento quando sono somministrate cellulestaminali =Laminin =Dystrophin = nucleo https://www.clinicaltrialsregister.eu/ctr-search/trial/2011-000176-33/IT Conclusionieprospettive o Il muscolo contiene diversi tipi di cellule staminali che contribuiscono al suo sviluppo e alla rigenerazione dopo un danno o Nelle distrofie muscolari il processo di rigenerazione è compromesso o Diversi protocolli sperimentali su animali modello di distrofia hanno dimostrato che la somministrazione di cellule staminali migliora la morfologia e la funzionalità del muscolo o Sono in corso trial clinici con cellule staminali in pazienti con Distrofia Muscolare di Duchenne: al momento questi studi hanno dimostrato che il trapianto è una procedura relativamente sicura anche se per arrivare realmente ad una cura è necessaria l’ottimizzazione di diversi parametri quali: • Modalità di somministrazione delle cellule (quantità e frequenza) • Età di inizio della somministrazione • Combinazione con altri farmaci che migliorano il reclutamento delle cellule e il loro differenziamento miogenico • Combinazione con terapia genica e uso di nuove tecnologie (es. CRISPRCAS9 ) Gene editing in vivo o ex vivo: dalla fantascienza alla realtà? Cell Stem Cell7 April 2016, Vol.18(4):533– 540, doi:10.1016/j.stem.2016.01.021 Short Article A Single CRISPR-Cas9 Deletion Strategy that Targets the Majority of DMD Patients Restores Dystrophin Function in hiPSCDerived Muscle Cells
