Lezione 4 Predizione di geni

Genomics Session
Lezione 4
Predizione di geni
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Valutazione dei vari metodi
A livello di nucleotide:
TN
FN
TP
FP
TN
FN
TP
FN
TN
Realtà
Predizione
Realtà
Lezione 4
TP
nc
FP
Sensitività
Sn = TP / (TP + FN)
Specificità
nc
Predizione
c
c
FN
TN
Sp = TP / (TP + FP)
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Valutazione dei vari metodi
A livello di esone:
Esone
sbagliato
Esone
corretto
Esone
mancante
Realtà
Predizione
Sensitività
Sn =
Numero di esoni correttamente predetti
Numero di esoni nel dataset
Numero di esoni correttamente predetti
Specificità
Lezione 4
Sp =
Numero di esoni predetti
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Valutazione dei vari metodi
A livello di gene:
Si considera una predizione corretta a livello di gene se tutti i suoi esoni
sono stati correttamente predetti.
Sensitività
Sn =
numero di geni correttamente predetti
numbero di geni nel dataset
numero di geni correttamente predetti
Specificità
Lezione 4
Sp =
numero di geni predetti
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Valutazione dei vari metodi
Lezione 4
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Valutazione dei vari metodi
Brent, Nature Reviews Genetics 2008
Lezione 4
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Strategia per l'annotazione di un genoma
Brent, Nature Reviews Genetics 2008
2
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale
2010/2011 Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Genomica A.A.
Computazionale,
Limiti degli algoritmi per identificazione di geni
Non possono identificare:
Geni sovrapposti;
Geni annidati;
Frame-shifts o errori di sequenziamento;
Codoni di inizio e stop alternativi;
Giunzioni di splicing non canoniche;
Splicing alternativo;
Salto del codone di stop (TGA) causato da selenocisteine;
Sono in genere organismo-specifici;
Identificano bene geni simili a qualcosa visto in precedenza;
Sono disegnati per identificare solo geni codificanti per proteine.
Lezione 4
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Genomics Session
Lezione 4
Splicing alternativo
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Splicing alternativo
Processo mediante il quale il trascritto di un gene può essere
riarrangiato dando luogo a mRNA diversi;
●
Importante meccanismo regolatorio per la modulazione delle funzioni e
caratteristiche dei prodotti proteici dei geni eucariotici;
●
Studi genomici su larga scala suggeriscono che fra il 70-80% dei geni
umani può dar luogo ad almeno due diversi mRNA (isoforme) mediante
splicing alternativo;
●
Possibile spiegazione del paradosso del ridotto numero di geni negli
organismi superiori
●
Lezione 4
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Processamento dei pre-mRNA
Lezione 4
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Processamento dei pre-mRNA
Il processamento di un pre-mRNA è cotrascrizionale
Lezione 4
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Scoperta dello splicing alternativo
- Inizialmente predetto da Walter Gilbert nel 1978;
- Dimostrato per la prima volta peril gene per la
catena pesante delle immunoglobuline nel 1980
(Edmund Choi, Michael Kuehl & Randolph Wall,
Nature 286, 776 – 779)
- Lo splicing produce due isoforme della proteina con
diversa regione C-terminale:
● Una forma più corta, che è secreta
● Una più lunga che rimane ancorata alla
membrana plasmatica
S - signal peptide
V - variable region
C - constant region
Red – untranslated region
Green – membrane anchor
Yellow – end of coding reg. for
secreted form
Lezione 4
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Splicing alternativo
Il pre-mRNA della troponina T può dar
luogo a 64 diverse isoforme della proteina
nel muscolo
Constitutively spliced exons (exons 1-3, 9-15, and 18)
Mutually exclusive exons (exons 16 and 17)
Alternatively spliced exons (exons 4-8)
Gli esoni 4-8 sono “spliceati” in ogni possibile
combinazione dando luogo a 32 combinazioni diverse
Gli esoni 16 e 17, che sono mutualmente esclusivi,
raddoppiano le possibilità, quindi in totale si possono
avere 64 isoforme
Lezione 4
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Splicing alternativo
Gene DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule) di Drosophila
> 38000 isoforme di splicing
[Graveley et al., 2001]
Lezione 4
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Splicing alternativo
Gene
5’
mRNA1
mRNA2
mRNA3
mRNA4
mRNA5
Lezione 4
exon 1
exon 2
exon 3
exon 1
exon 2
exon 3
exon 2
exon 3
exon 1’
exon 1’’
exon 1
exon 1’’’
exon 1
3’
exon 3
exon 2
exon 2
exon 3
exon 3’
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Tipi di splicing alternativo
Lezione 4
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Splicing alternativo
Effetti dello splicing alternativo:
- Inclusione/esclusione di domini funzionali in proteine;
- Cambiamenti della struttura terziaria;
- Cambiamenti nelle UTR, influenzando la stabilità del mRNA e l'efficienza
della traduzione.
Alterazione delle capacità di legare partner, es. recettore/ligando
Alterazione della localizzazione subcellulare, es. inserzione in membrana
Alterazione della localizzazione extracellulare, es. secrezione
Alterazione delle attività enzimatiche o di signaling
Alterazione della stabilità della proteina, es. inclusione di siti di taglio
Inserzione di regioni modificabili post-trascrizionalmente
Lezione 4
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Modello di un gene
Si definiscono 4 tipi di esoni in funzione della posizione relativa:
• Esoni iniziali, dal codone di inizio al primo sito donatore;
• Esoni interni, da un sito accettore al sito donatore successivo;
• Esoni terminali, dall'ultimo sito accettore al codone di stop;
• Esoni singoli, dal codone di inizio al codone di stop (in geni senza
introni).
Lezione 4
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Modello di un gene
Si definiscono 4 tipi di esoni in funzione dello splicing:
• Esoni costitutivi, condivisi da tutte le isoforme;
• Esoni specifici, propri di una sola isoforma;
• Esoni alternativi, condivisi da un sottoinsieme di tutte le isoforme;
• Esoni overlappanti, possono avere regioni costituive, alternative o
specifiche.
Lezione 4
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Modello di un gene
[Leoni et al., 2010]
Lezione 4
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Dimensioni esoni/introni
Species
Yeast
Nematode
Fruit fly
Chicken
Mammals
Lezione 4
Average
exon No.
1
4
4
9
7
Average
intron No.
0
3
3
8
6
Average
length(kb)
1.6
4.0
11.3
13.9
16.6
Average
kb mRNA
1.6
3.0
2.7
2.4
2.2
% exon
per gene
100
75
24
17
13
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Giunzioni di splicing
Lezione 4
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Meccanismo dello splicing
Lezione 4
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Meccanismo dello splicing
Legame dgli snRNP U1 e U2
Riarrangiamento delle interazioni fra
snRNPs, rilascio di U1 e U4
Legame degli snRNP U4, U5 e U6
Lezione 4
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Meccanismo dello splicing
Il core catalitico, formato da U2 e U6,
catalizza la prima reazione di
transesterificazione
Lezione 4
Ulteriori riarrangiamenti fra U2, U6 e U5
portano alla seconda reazione di
transesterificazione
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Meccanismo dello splicing
L'ipotesi di definizione degli esoni
Fattori diversi interagiscono con esoni e introni
Lezione 4
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Controllo dello splicing alternativo
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Controllo dello splicing alternativo
[Maniatis & Tasic, 2002]
Lezione 4
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Controllo dello splicing alternativo
Lo splicing degli esoni è modulato da:
Proteine – proteine SR e hnRNPs
Elementi cis in introni ed esoni – splicing enhancers e silencers
ESE - Exonic Splicing Enhancer
ESS - Exonic Splicing Silencer
ISE - Intronic Splicing Enhancer
ISS - Intronic Splicing Silencer
Differenze nelle attività e/o quantità dei fattori di splicing generali e/o in quelli
specifici in particolari condizioni (ad es durante lo sviluppo, in tessuti diversi,
in risposta a stimoli) può causare splicing alternativo
Lezione 4
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Identificazione di casi di splicing alternativo
Analisi dello Splicing Alternativo:
●
Due obiettivi principali:
●
Identificare casi di splicing alternativo
–
●
Identificare come lo splicing alternativo è
regolato
–
Lezione 4
Quali sono le diverse isoforme di un gene?
Quali sono i motivi di sequenza che controllano lo
splicing, e che determinano quali isoforme sono
espresse in un determinato momento
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Identificazione di casi di splicing alternativo
• Dati: sequenze di cDNA, EST,
proteine
• Confrontare i dati di sequenza
con l'assemblaggio genomico
• Confrontare i dati di sequenza
fra di loro
Lezione 4
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Identificazione di isoforme mediante microarrays
Exon junction arrays
Exon arrays
[Blencowe, 2006]
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Identificazione dello splicing alternativo
Confronto diretto di
cDNA
Confronto di cDNA
mappati sul genoma
Confronto di dati di
espressione da
microarray
[Florea, 2006]
Lezione 4
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Identificazione dello splicing alternativo
I metodi descritti si basano sulla conoscenza della sequenza
completa dei trascritti di un gene
La sequenza completa è usata per mappare sul genoma, per
confrontare coppie, o per disegnare probes per microarrays
Le EST invece forniscono sequenze incomplete
Date tutte le osservazioni di sequenze per un dato gene, inclusi full
length cDNAs, ESTs e arrays di espressione, lo scopo e' di inferire il
set piu' verosimile di isoforme full-length che spiegano I dati
osservati. Si tratta di assemblare varie sequenze full length da una
mistura di sequenze frammentarie.
Lezione 4
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Librerie di ESTs
EST = Expressed Sequence Tag
Partial cDNA sequences created from expressed mRNA (200-400 bp in length)
[Brent, Nature Reviews Genetics 2008]
Lezione 4
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Librerie di ESTs
A
B
A’
C
Lezione 4
C’
A’
B
A’
B
Gene
A’: suffisso di A
C’: prefisso di C
D’: prefisso di D
B
B
D
D
A
EST
C
D’
C
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Librerie di ESTs
Gruppi di EST i cui allineamenti locali sul genoma finiscono o iniziano nello stesso
posto identificano giunzioni esone/introne
A
B
A’
A
C
D
C
D
Gene
B
EST
B
A’
B
A’
B
C’
D’
C
splice junction
Lezione 4
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Librerie di ESTs
[Modrek & Lee, 2002]
Lezione 4
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Librerie di ESTs
Le EST derivano da tutti i mRNA del campione, quindi vanno raggruppati
insieme secondo il mRNA di provenienza per poterne ricostruire la
sequenza
Dati di EST contengono molti errori:
Spesso incompleti
Inaccurati
Campionamento non uniforme
Contaminazioni
Il mRNA potrebbe non essere maturo
La grande mole di dati di EST le rende comunque molto utili
Sono disponibili anche per organismi per i quali la sequenza del genoma
non è nota o è incompleta
Lezione 4
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Librerie di ESTs
Un EST è una sequenza parziale di un trascritto; per ricostruire il trascritto:
●
Confrontare tutte le sequenze delle EST una contro l'altra;
●
Identificare overlap significativi;
●
Raggruppare sequenze con overlap compatibili in gruppi (clusters);
●
Assemblare le sequenze di ogni cluster.
UniGene (NCBI) è una banca dati di clusters di EST predetti provenire dallo
stesso gene, ottenuti con varianti di algoritmi di assemblaggio
Problemi:
- Overclustering: I geni paraloghi potrebbero essere raggruppati insieme in
un unico cluster
- Underclustering: il numero di EST potrebbe essere insufficiente
- Computazionalmente Intensivo
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Librerie di ESTs
Obiettivo: dato un cluster di EST, identificare tutti i trascritti da cui hanno origine
GenBank (dbEST),
EMBL, DDBJ
Cluster di EST
Assemblaggio
Banca dati primaria
Consenso
EST
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Librerie di ESTs
Obiettivo: dato un cluster di EST, identificare tutti i trascritti da cui hanno origine
GenBank (dbEST),
EMBL, DDBJ
Banca dati primaria
Consenso 1
Cluster di EST
Consenso 2
Trascritti putativi
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Librerie di ESTs
Lo splicing alternativo può causare assemblaggi di EST spesso
sbagliati, tronchi o ambigui se fatto con tecniche convenzionali
sbagliato
troncato
troncato
EST cluster
corretto
Lezione 4
troncato
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Splicing graphs (Heber, 2002)
(adenylosuccinate lyase)
[Heber et al., 2002]
Lezione 4
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Rappresentazione dello splicing
Lezione 4
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Identificazione dello splicing alternativo
Confronto di clusters
di EST
Splicing
graphs
[Florea, 2006]
Lezione 4
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Splicing graphs (Heber, 2002)
Il problema di assemblare sequenze consenso può essere ricondotto
a un problema di ricostruzione di un grafo:
Dato un cluster di EST, tovare il grafo ottimale (splicing graph) che
rappresenti tutti i trascritti come percorsi nel grafo
Lezione 4
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Splicing graphs (Heber, 2002)
Se è nota le sequenza del genoma di riferimento:
- Mappare gli EST/cDNA sul genome
- Verificare l'allineamento (siti di splicing, qualità)
- Connettere le posizioni consecutive
transcript 1
genomic seq.
transcript 2
splicing graph
Si possono generare combinatorialmente tutti i possibili trascritti
alternativi
Ovviamente non tutti saranno veri trascritti
Bisogna dare un punteggio ai candidati trascritti, per differenziare
quelli veri dai falsi
Lezione 4
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Splicing graphs (Heber, 2002)
Nodi: Esoni
Archi: Introni
Gene: directed acyclic graph
Ogni percorso nel DAG descrive un trascritto alternativo
Per DAG complessi, ci saranno moltissimi possibili percorsi
Gli archi devono essere pesati (numero di EST che unisce due esoni,
dati di espressione)
Lezione 4
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Splicing graphs (Heber, 2002)
Set di mRNA S={s1,s2 . .sn}
Vi = Set di coordinate (o genomiche, o relative al cluster) per ogni
nucleotide si
Splicing graph G
Vertici di G = unione di Vi = tutte le basi
Se le basi v e w sono consecutive in un transcritto/EST, sono unite
da un arco
Ogni transcritto si = percorso nel grafo
Lezione 4
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Splicing graphs (Heber, 2002)
Se non è nota le sequenza del genoma di riferimento:
- Si deve ricostruire il grafo dalle sequenze degli EST
- Si divide la seuenza dell'EST in k-meri (20-meri).
- Si costruisce il grafo usando i k-meri come vertici, connettendoli se occorrono
consecutivamente nella sequenza
Esempio (3-meri):
Sequenze: CTCGATGAC, CTCGGAC
Vertici:
{CTC, TCG, CGA, GAT, ATG, TGA, GAC, CGG, GGA}
CGG → GGA
CTC → TCG → CGA → GAT → ATG → TGA
→ GAC
CTCG → AT → GAC
splicing graph semplificato
Lezione 4
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Splicing graphs (Heber, 2002)
Lezione 4
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Splicing graphs
Una volta stabilito un sistema per dare un punteggio ad un percorso nel grafo,
si devono ricercare i trascritti migliori:
- in maniera esaustiva (Heber)
- Expectation maximization
- dynamic programming
Lezione 4
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Plausibilità strutturale di varianti di splicing
[Romero et al., 2006]
Lezione 4
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Plausibilità strutturale di varianti di splicing
Protein Structure
Modeling
• Ab initio modeling
• Threading & Fold Recognition
• Homology Modeling
MNIFEMLRID
HLLTKSPSLN
DEAEKLFNQD
LDAVRRCALI
LQQKRWDEAA
TTFRTGTWDA
Lezione 4
EGLRLKIYKD
AAKSELDKAI
VDAAVRGILR
NMVFQMGETG
VNLAKSRWYN
YKNL
TEGYYTIGIG
GRNCNGVITK
NAKLKPVYDS
VAGFTNSLRM
QTPNRAKRVI
?
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Plausibilità strutturale di varianti di splicing
Modelli per omologia di
proteine soggette a
splicing alternativo;
La parte viola indica
regioni rimosse da
eventi di splicing in
alcune isoforme
Hemoglobin delta-subunit
SET domain-containing protein 3
Mitochondrial cysteine desulfurase
Lezione 4
Initiation factor 6
[Tress et al., 2007]
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Genomics Session
Lezione 4
Geni per RNA non codificanti
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
RNA non codificante
●
●
●
●
●
Lezione 4
Di tutto l'RNA trascritto negli eucarioti superiori, il 98% non è
mai tradotto in proteine;
Di questo 98%, circa il 50-70% è costituito da introni;
Il resto origina da geni non codificanti proteine, fra cui geni
per rRNA, tRNA e una vasta serie di altri geni per RNA non
codificante (non-coding RNA, ncRNAs);
Anche alcuni introni sono stati visti contenere ncRNAs, ad
exsempio gli snoRNA;
Il numero di ncRNA diversi nei genomi di mammifero è
sconosciuto (alcuni dicono fino a 10000);
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Tipi di ncRNA
Gli ncRNA si possono genericamente classificare in due gruppi
in base alla loro funzione:
●
●
●
Lezione 4
NcRNA housekeeping, i quali sono espressi sempre e sono
necessari per le funzioni normali e la sopravvivenza della cellula;
NcRNA regolatori, i quali sono espressi per rispondere a
particolari esigenze;
NcRNA regolatori possono influire sull'espressione di altri geni
modulando la loro trascrizione o traduzione
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Tipi di ncRNA
Esempi di ncRNA housekeeping:
• Apparato per la sintesi proteica:
●
Transfer RNA (tRNA);
●
RNA Ribosomiale (rRNA);
●
snRNA: RNA dello spliceosoma;
●
snoRNA (small nucleolar RNA) : ruolo accessorio agli rRNA;
• tmRNA (tRNA like mRNA): degradazione delle proteine;
• gRNA: editing dell'RNA;
• RNA della telomerasi: primer per la sintesi del DNA dei telomeri;
Lezione 4
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Tipi di ncRNA
L'RNA 4.5S e l'RNA 7S fanno parte
della signal recognition particle
(SRP);
Questi RNA tengono insieme le
subunità proteiche della SRP e
aiutano il legame al ribosoma;
La SRP riconosce sequenze
aminoacidiche segnale all'estremità
N-terminale della catena
polipeptidica nascente;
Il riconoscimento del segnale induce
l'attacco del ribosoma al reticolo
endoplasmatico, nel quale la
proteina nascente si avvia verso la
secrezione.
Lezione 4
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Tipi di ncRNA
Esempi di ncRNA regolatori:
•
•
•
•
•
Lezione 4
Micro RNA (miRNA): regolatori della traduzione;
Small interfering RNAs (siRNA): silenziamento di geni;
Riboswitch RNA: controllo dell'espressione genica;
ncRNA modulatori delle funzioni di proteine;
ncRNA regolatori della localizzazione di RNA e proteine.
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Tipi di ncRNA
Ribozimi:
• Sono molecole di RNA capaci di attività catalitica;
• In natura sono stati osservati prevalentemente associati ad introni
capaci di self-splicing e in RNA codificato nel genoma di parassiti
intracellulari (viroidi);
• Anche il ribosoma è considerato da alcuni un ribozima, dato che la
formazione del legame peptidico è catalizzata da RNA;
• Questi ribozimi osservati in natura sono in grado di catalizzare
reazioni implicate nel taglio e unione di molecole di RNA, e spesso
agiscono su loro stessi;
• Several synthetic ribozymes are cabaple of performing other
reactions than RNA cleavage and ligation
Lezione 4
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RNA world
Proteine: diversità e catalisi
DNA: stabilità e
immagazzinamento
RNA: diversità,
immagazzinamento e
catalisi
Lezione 4
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RNA world
• Nell'ipotesi di un mondo in cui le uniche molecole biologiche erano
basate su RNA, è necessario immaginare una molecola di RNA
capace di sintetizzare RNA, cioè una RNA polimerasi fatta di RNA;
• Anche se nessuna molecola di questo tipo è nota, un RNA capace
di replicare altro RNA è stato selezionato in vitro da librerie di
sequenze di RNA casuali;
Questa ribopolimerasi è lunga
165 nt;
Capace di copiare 14 nucleotidi
in 24 ore, con precisione del
97%;
Altre attività enzimatiche
selezionate in vitro: RNA ligasi,
fosforilazione di RNA, taglio di
RNA, formazione di legami
peptidici, formazione di legami
aminici.
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
RNA world
Un ipotetico mini ribo-organismo
[Bartel & Unrau, 1999]
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Tipi di ncRNA
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Geni per ncRNA
Diverse caratteristiche:
Possono essere espressi come parte di un gene codificante per
proteine;
Possono far parte di un unico trascritto precursore da cui sono estratti
diversi ncRNA;
Possono essere molto corti, o molto lunghi;
Possono avere introni, e subire splicing;
Possono essere espressi da pseudogeni di geni codificanti proteine;
Possono essere trascritti dalla RNA polimerasi II o dalla III;
Possono essere poliadenilati.
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Geni per ncRNA
Non sono generalmente identificabili con metodi per geni
codificanti proteine
●
Segnali
–
–
–
●
Caratteristiche composizionali
comuni
–
–
–
–
●
Lezione 4
ATG
TAA, TGA, TAG
GT…..AG
c
Lunghezza degli esoni
Lunghezza degli introni
Codon bias
Altre caratteristiche genomiche
?
?
Omologia (allineamento in cis)
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011
Geni per ncRNA
Svolgono la loro funzione:
In maniera sequenza-specifica (es. per appaiamento di basi con un
target);
In maniera struttura-specifica (es. per interazione con ligandi proteici);
In maniera sia sequenza- che struttura-specifica.
Lezione 4
Genomica Computazionale, Laurea Magistrale A.A. 2010/2011