Focus
■ Stefania Arioli1, Fabio Masotti1, Giulia della Scala1, Ivano De Noni1, Diego Mora1, Fabio Dal Bello2
Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze per gli Alimenti la Nutrizione e l’Ambiente (DeFENS) - 2Sacco Srl
1
Acido
formico:
aspetti tecnologici e normativi
in ambito lattiero-caseario
L’acido formico è un acido organico naturalmente presente
nel latte, ma è anche un prodotto del metabolismo
di Streptococcus thermophilus, batterio lattico impiegato
per la preparazione di diversi latti fermentati e formaggi.
Pertanto, l’acido formico si trova anche nelle colture starter
contenenti Streptococcus thermophilus, nello yogurt
e in diversi prodotti caseari
L’acido formico in latte e derivati
Nel latte gli acidi organici, a eccezione dell’acido citrico, rappresentano composti minori che in ragione del pH sub-acido del latte
(pH 6,6-6,8), sono prevalentemente presenti
come sali. L’acido formico presente nel latte
può originarsi a seguito dei processi di risanamento del latte, proporzionalmente all’intensità del trattamento termico applicato.
Nello specifico, questo acido si forma quale
prodotto di reazioni chimiche a carico del lattosio e riconducibili alla caramellizzazione e
alla reazione di Maillard (Berg and van Boekel, 1994; van Boekel 1998). Nel latte fresco
pastorizzato di alta qualità abbiamo rilevato quantitativi di acido formico pari a circa
5-10 mg/L in funzione dei lotti di produzione. In diverse categorie di latte in polvere
per uso alimentare i livelli di acido formico
riscontrati in letteratura risultano piuttosto
variabili oscillando tra un valore minimo di
23 mg/kg e un massimo di 200 mg/kg in funzione del produttore. Tuttavia, tale variabilità è risultata essere funzione anche del lotto
di produzione, oscillando in alcuni casi tra
23 e 156 mg/kg.
L’acido formico viene prodotto anche dall’attività metabolica di Streptococcus thermophilus che, in miscela con altri microrganismi, costituisce uno dei batteri lattici più
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comunemente utilizzati dall’industria lattiero-casearia per la preparazione di latti fermentati, yogurt e moltissimi formaggi. Tutti
questi prodotti contengono quindi quantità
significative di acido formico variabili in relazione all’attività metabolica del batterio. Nel
caso dello yogurt, e in molti formaggi, i livelli
di acido formico dipendono sia da fattori tecnologici (tipo di latte e trattamento termico,
temperatura di fermentazione) che dalla crescita di S. thermophilus. In letteratura nello
yogurt vengono riportati valori compresi tra
40 e 2100 mg/L (Robinson 2002; Ligor 2008),
sebbene determinati con diverse metodiche
analitiche. Nei formaggi, l’attività di S. thermophilus contribuisce alla formazione di acido formico la cui concentrazione aumenta in
genere con il progredire della maturazione.
Il confezionamento sottovuoto è un altro fattore favorente la produzione di acido formico nel formaggio poiché l’assenza di ossigeno tende a stimolare le attività enzimatiche
che in S. thermophilus portano alla sintesi di
questo acido organico (Horiuchi and Sasaki
2012). La letteratura scientifica riporta valori di questo acido organico nei formaggi in
un intervallo da 4 fino a 2960 mg/kg. Questo
ampio intervallo di valori relativamente alla
concentrazione di acido formico nei prodotti caseari è potenzialmente conseguenza di
almeno tre importanti fattori:
f l’uso di diverse tecnologie di produzione;
f l’impiego di ceppi diversi di S. thermophilus;
f l’utilizzo di diversi sistemi analitici per la
determinazione di questa molecola in matrici casearie.
Il ruolo tecnologico dell’acido
formico nel processo di
acidificazione microbica del latte
La produzione di acido formico da parte di
S. thermophilus è nota da oltre 50 anni (Galesloot, 1968, Veringa et al., 1968) e dagli anni ’90 è riconosciuto il suo effetto positivo
sullo sviluppo in latte di colture di batteri
lattici starter durante il processo fermentativo (Perez 1990). L’associazione microbica tra S. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus rappresenta uno
degli esempi più studiati di cooperazione metabolica tra due specie batteriche in un contesto alimentare. Tale interazione è positiva per
entrambe le specie coinvolte ed è nota come
mutualismo o proto-cooperazione (Sieuwerts et al., 2008). Essenzialmente essa si basa
sull’approvvigionamento di fattori nutrizionali che i due microrganismi si scambiano
vicendevolmente. L’attività proteolitica di L.
delbrueckii libera peptidi e aminoacidi che
50
7
40
Acido formico (mg/L)
Acidificazione del latte (pH)
45
6,5
6
5,5
25 min
5
pH 4,6 ± 0,1
4,5
35
30
25
20
15
10
5
4
0
50
100
150
200
250
0
300
0
50
Tempo (min)
6,80
6,60
6,40
6,20
6,00
5,80
5,60
5,40
5,20
5,00
4,80
4,60
4,40
4,20
4,00
0
1
2
3
150
200
Tempo (min)
6,80
6,60
6,40
6,20
6,00
5,80
5,60
5,40
5,20
5,00
4,80
4,60
4,40
4,20
4,00
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Formiato di sodio (10 mg/L)
0
1
2
3
250
300
Figura 2. Quantificazione dell’acido formico nel corso della
fermentazione della coltura starter Y078 in latte fresco pastorizzato
di alta qualità in assenza (linea rossa) e a seguito dell’addizione
di formiato di sodio alla concentrazione finale di 10 mg/L (linea verde)
e 20 mg/L (linea blu)
Tempo (ore)
Acidificazione del latte (pH)
S. thermophilus, generalmente proteasi negativo, richiede per una crescita efficiente
in latte; al contrario, nello stesso tempo, S.
thermophilus produce anidride carbonica
favorendo la crescita di L. delbrueckii. Inoltre, S. thermophilus fornisce acido formico,
il cui ruolo non è ancora stato chiarito ma è
risultato essere in grado di stimolare il metabolismo microbico di entrambe le specie
coinvolte nella produzione di yogurt. L’acido
formico è un prodotto dall’attività dell’enzima piruvato formiato liasi, peculiare solo di
S. thermophilus tra le specie coinvolte nel
consorzio dello yogurt.
La produzione di acido formico sembra essere fortemente favorita da condizioni di anaerobiosi nel latte (Horiuki and Sasaki 2012)
mentre la sintesi di questo enzima è inibita
dalla presenza nel latte di concentrazioni di
acido formico e di purine (adenina e guanina) rispettivamente di 5 mM e 50 μM (Derzelle et al. 2005). L’effetto positivo dell’acido
formico stimolante la crescita degli starter
dello yogurt ha come conseguenza anche un
aumento della velocità di acidificazione e,
pertanto, una riduzione dei tempi di fermentazione, rendendo il formiato stesso un possibile candidato a coadiuvante tecnologico
nelle fermentazioni casearie.
Nonostante l’assenza di letteratura scientifi-
Acidificazione del latte (pH)
Figura 1. Curve di acidificazione in latte fresco pastorizzato di alta qualità
della coltura starter Y478F, composta da S. thermophilus ST671 e Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus LB08. La curva di acidificazione in assenza di
aggiunte di formiato di sodio è in rosso. Le curve di acidificazione ottenute
addizionando il latte di 10 e 20 mg/L di formiato di sodio sono rappresentate
rispettivamente dalle linee verde e blu. L’esperimento è stato condotto a 42 °C
100
4
5
6
7
8
9
Figura 3. Curve
di acidificazione
in latte magro
ricostituito (linea
rossa), latte
pastorizzato per
uso caseario (linea
verde) e latte fresco
pastorizzato di alta
qualità (linea blu)
della coltura starter
S. thermophilus
ST115, in assenza
e in presenza di
formiato di sodio
addizionato alla
concentrazione
finale di 10 mg/L.
L’esperimento
è stato condotto
a 42 °C
10 11 12 13 14 15 16
Tempo (ore)
ca in merito e la mancanza di una vera normativa di riferimento, diversi organismi nazionali hanno autorizzato l’aggiunta di acido
formico o formiato alle colture starter sulla
base di specifiche richieste pervenute di alcuni produttori di colture. Per esempio, nel
1990 il Conseil Supérieur de la Santé francese ha autorizzato l’aggiunta di acido formico
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o dei suoi sali alla colture starter nel limite
del 5%. Detto limite si riferisce a colture starter concentrate e congelate senza obbligo
di indicazione dell’aggiunta in etichetta. Nel
2007 in Danimarca, la Veterinary and Food
Administration ha consentito l’aggiunta nel
limite del 20% (come acido formico) sulla
coltura finale. È infine utile ricordare che,
all’interno dell’UE, i sali di calcio o di sodio dell’acido formico sono consentiti quali
conservanti per alimenti animali e i sali di
sodio dello stesso acido come additivi per
insilati. Una recente opinione dell’EFSA [EFSA Journal 2015; 13 (5):4056] ha ribadito la
sicurezza del formiato di calcio o di sodio
per gli alimenti destinati alle specie zootecniche, per il consumatore e per l’ambiente,
anche quando utilizzati alla massima concentrazione consentita (10.000-12.000 mg/
kg di alimento). Di seguito verranno descritti
alcuni risultati relativi all’effetto dell’addizione di minime quantità di acido formico in latte sulla velocità di acidificazione di colture
starter al fine di fornire le prime indicazioni
circa il potenziale utilizzo di questa molecola nel settore lattiero-caseario. Le performance di crescita e di acidificazione di miscele commerciali di S. thermophilus e L.
delbrueckii sono state determinate in latte
fresco pastorizzato di alta qualità in presenza di concentrazioni crescenti di formiato
di sodio (10 o 20 mg/L). In presenza di formiato di sodio alle concentrazioni di 10 e 20
mg/L si è verificato un aumento della velocità di acidificazione, con il raggiungimento
del valore di pH 4,6±0,1 (valore considerato
come termine dell’acidificazione durante un
processo produttivo) con circa 25 minuti di
anticipo rispetto alla condizione di controllo in assenza di formiato (fgura 1). La determinazione enzimatica della concentrazione
di acido formico (Boehringer Mannheim/RBiopharm Formic acid UV-method) al termine dell’acidificazione ha evidenziato una
maggiore concentrazione di formiato nella
condizione di controllo (35 mg/L) rispetto ai
campioni in cui era stato aggiunto formiato di sodio e nei quali si misurava una concentrazione finale di acido formico pari a 26
mg/L. Questi risultati portano a ipotizzare
che l’acido formico esogeno aggiunto al latte venga prontamente impiegato dalle colture microbiche limitando fenomeni di accumulo con il formiato endogeno prodotto da
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Tabella 1. Effetto della presenza di formiato di sodio sui parametri
cinetici di crescita di S. thermophilus in terreno chimicamente
definito (CDM)
Parametri cinetici di crescita
terreno CDM, aggiunto di formiato
di sodio (20 mg/L)
terreno CDM
ceppo
V max
LagTime
OD finale
V max
Lag-Time
OD finale
DSM
20617
5,24±0,04
15:11±00:08
1,8±0,1
6,5±0,2
14:31±00:24
1,91±0,02
CNRZ
385
6,3±0,2
09:03±00:12
1,44±0,04
6,0±0,2
07:16±00:07
1,34±0,04
ST24
11,5±0,1
07:26±00:25
1,97±0,005
11,6±0,06
07:05±00:04
1,97±0,001
ST115
9,1±0,1
07:51±00:10
1,77±0,02
8,5±0,4
07:40±00:23
1,77±0,02
ST671
1,8±0,1
05:03±00:25
0,84±0,05
2.0±0,1
04:59±00:11
0,93±0,04
735
6,3±0,4
08:42±00:03
1,37±0,04
6,4±0,1
08:12±00:15
1,38±0,04
417
9,6±0,07
05:58±00:07
1,91±0,003
8,3±0,3
05:15±00:07
1,86±0,01
N2
5,9±0,06
09:13±00:02
1,35±0,02
5,9±0,07
09:10±00:02
1,38±0,04
03
5,1±0,1
12:06±00:14
1,59±0,02
4,8±0,3
11:48±00:35
1,65±0,01
387
8,3±0,2
06:33±00:14
1,94±0,03
8,6±0,1
06:18±00:04
1,94±0,02
463
5,3±0,4
04:50±00:04
1,11±0,07
5,1±0,05
04:59±00:15
1,04±0,01
02
4,4±0,1
09:32±00:05
0,84±0,02
4,1±0,3
09:30±00:09
0,79±0,06
460
3,3±0,3
07:22±00:03
1,02±0,05
3,5±0,1
06:41±00:12
1,04±0,04
357
2,0±0,2
16:34±00:34
0,74±0,02
1,7±0,03
16:35±00:11
0,64±0,02
433
3,4±0,07
16:12±00:14
0,93±0,01
3,4±0,1
15:32±00:18
0,98±0,01
412
4,8±0,06
04:36±00:09
1,16±0,04
4,8±0,1
04:32±00:09
1,18±0,05
407
4,9±0,3
09:29±00:18
1,20±0,02
5,3±0,1
09:15±00:11
1,17±0,01
V max, velocità massima espressa come mOD600nm/min; LagTime, tempo di latenza espresso in h e min;
OD finale, densità cellulare finale raggiunta a termine dell’incubazione a 37 °C per 24 h, espressa come
valore di OD600nm. Tutti i valori sono la media di tre determinazioni±deviazione standard.
S. thermophilus durante la crescita in latte
(figura 2). Diversi ceppi di S. thermophilus
tra i quali quelli precedentemente utilizzati
in latte in miscela con L. delbrueckii, sono
stati impiegati per lo studio dei loro parametri cinetici di crescita (durata della fase
di latenza, velocità di crescita e concentrazione cellulare finale) utilizzando un terreno sintetico chimicamente definito (Reiter
and Oran 1962). I risultati ottenuti (tabella
1) hanno evidenziano effetti positivi su molti
dei ceppi analizzati che si concretizzano per
lo più in una riduzione della fase di latenza. I
risultati delle prove condotte su terreno chimicamente definito evidenziano però come
l’effetto dell’acido formico sia ceppo-dipendente. La ragione per cui il formiato sia in
grado di stimolare positivamente il metabolismo microbico di queste colture starter non
è ancora stato chiarito e sicuramente necessita di ulteriori approfondimenti. Secondo
quanto descritto da Derzelle et al. (2005) il
metabolismo dell’acido formico in S. thermophilus sembrerebbe essere correlato alla biosintesi delle basi azotate puriniche. I
risultati ottenuti relativamente alla sensibilità di S. thermophilus e L. delbrueckii alla
presenza del formiato mettono in evidenza
come il controllo e la standardizzazione dei
processi di fermentazione dipendano dalla
concentrazione di acido formico nel latte,
concentrazione che varia in funzione della
qualità del latte e del trattamento termico
che ha subito. Di conseguenza, si potrebbe ipotizzare l’impiego dell’acido formico o
dei suoi sali come coadiuvante tecnologico
avente la funzione di ridurre i tempi di fermentazione in latte e di migliorare la standardizzazione del processo di acidificazione
soprattutto in formulazioni di latte a basso
contenuto di acido formico, cioè nel caso in
cui la sua concentrazione fosse inferiore alle
necessità metaboliche delle colture microbiche utilizzate. A titolo di esempio vengono
mostrate in figura 3 le curve di acidificazione
ottenute con la coltura starter S. thermophilus ST115 su tre diverse preparazioni di latte,
in presenza e in assenza di acido formico. I
risultati mostrano chiaramente che l’addizione di 10 mg/L di formiato di sodio ha ridotto
considerevolmente la variabilità nei profili delle curve di acidificazione conseguente
all’impiego di diversi preparazioni di latte.
Prospettive future relative
all’impiego di acido formico
e dei suoi sali nelle fermentazioni
casearie
Poiché l’acido formico viene prodotto
dall’attività metabolica di S. thermophilus,
negli starter commerciali di batteri lattici è
quindi comune ritrovare questo acido organico, molto del quale viene tuttavia perso durante la preparazione industriale dello
starter stesso. Nel corso di questo processo
le colture microbiche vengono concentrate mediante centrifugazione e/o filtrazione
con conseguente impoverimento del livello
di acido formico che viene allontanato insieme al brodo colturale esausto.
Ne consegue che l’aggiunta della coltura
starter concentrata nel latte non apporta
un’adeguata quantità di acido formico come invece si potrebbe ottenere dall’aggiunta di latto innesto o di una coltura liquida, a
fronte però di maggiori problematiche relative alla standardizzazione della quantità di
inoculo microbico e alla sua stabilità. L’assenza di adeguate concentrazioni di acido
formico si riflette quindi in un allungamento
dei tempi necessari per la desiderata acidificazione del latte.
Su queste basi, come detto, è stata proposta e, in alcuni Paesi consentita, l’aggiunta
di sali dell’acido formico agli starter in modo
da ripristinare nel latte inoculato un livello
di acido formico prossimo a 10-20 mg/L. In
questo contesto l’addizione di acido formico
o dei suoi sali a livello della coltura starter
potrebbe essere considerata una procedura
utile all’ottimizzazione del processo tecnologico di fermentazione del latte poiché migliora l’efficienza del processo di acidificazione
senza interferire sui valori finali di acido formico che normalmente si possono ritrovare
a termine della fermentazione come prodotto del metabolismo di S. thermophilus.
^
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