G.C. si è occupato di dinamica di proteine e DNA sia dal punto di

Relazione sull’attività del triennio 2005‐2008
A
Giuseppe Chirico
• Nascita: 14 Agosto 1963
• Laurea in Fisica, 1986 (unimi)
• Dottorato in Fisica, 1990 (unimi)
• Ricercatore FIS03: 1990-2000 (unimi)
• P.A. Fis/07: 2000-2005 (unimib)
• P.Str. Fis/07: 2005-2008 (unimib)
G.C. si è occupato di dinamica di proteine e DNA sia dal punto di
vista sperimentale, prevalentemente con tecniche di spettroscopia
ottica (light scattering, fluorescenza risolta in tempo, etc.), che dal punto
di vista teorico-simulativo con simulazioni di dinamica stocastica di
polimeri. Più recentemente G.C. ha avviato linee di ricerca nell’ambito
della microscopia ottica non lineare dedicata a applicazioni nella fisica
medica.
G.C. è autore di 96 lavori pubblicati su riviste internazionali con
peer review e svolge attività di referee per varie riviste come J.
Chem.Phys., Nature Photonics, Biophys.J., Biophys.Chem., Nanoletters.
I principali risultati della ricerca di G.C. sono:
a. Caratterizzazione sperimentale e teorica della dinamica interna di
molecole di DNA e complessi DNA-proteina.
b. Caratterizzazione sperimentale di processi di fotodinamica interna
a proteine fluorescenti con tecniche spettroscopiche di singola
molecola.
c. Realizzazione e implementazione di sistemi di microscopia non
lineare per applicazioni biofisiche e biomediche.
G.C. è membro dell’editorial board di Biomedical Optical Engineering
(IEEE), di Cell Biochemistry and Biophysics e di Biophysics Journal
(online).
G.C. è membro della Biophysical Society USA, della European
Biophysical Society (EBSA) ed è membro del comitato direttivo della
Società Italiana di Biofisica Pura e Applicata (SIBPA).
B
Attività Scientifica del Triennio: 1.10.2005-30.09.2008
Durante il triennio di ricerca 2005-2008 G.C. ha svolto principalmente ricerche in tre ambiti
legati a (1) studio della fotodinamica di proteine fluorescenti per usi bio-medici (Green Fluorescent
Proteins, GFP), (2) sviluppo di nano-sensori per la rilevazione di tracce di proteine in soluzione e/o
estratti cellulari e (3) sviluppo di sistemi per microscopia ottica non lineare ad alta risoluzione
spaziale e temporale per applicazioni di tipo biofisico su tessuti (condizione in-vivo).
Principali risultati raggiunti nel triennio (14 lavori su riviste internazionali a peer review).
a) Caratterizzazione della stabilità e della fotodinamica interna di mutanti della GFP, una proteina
fluorescente visibile di ampio utilizzo in Medicina e Biologia, allo scopo di sviluppare mutanti
della proteina adatti all’impiego in tecniche di microscopia e nanoscopia ottica, in particolare
tramite l’uso di eccitazione a due colori e modulata. Recentemente questo lavoro ha portato
alla proposta di sviluppare mutanti della GFP atti a migliorare il rapporto segnale rumore in
imaging a fluorescenza e a permettere la misura di dinamica cellulare al millisecondo (5
pubblicazioni).
b) Un secondo insieme di risultati ottenuti nel triennio consiste nello sviluppo di metodi di
diagnostica per la biologia. In questo campo sono stati utilizzati sistemi ibridi formati da
nanoparticelle o micro-composti (nano capsule polielettrolitiche) e da fluorofori o proteine
fluorescenti (GFP), atti a rilevare tracce di proteine in estratti cellulari, pH o ioni metallici. E’ in
fase finale di sviluppo un sensore basato su nanoparticelle d’oro, coloranti organici e anticorpi
per la rilevazione di proteine a concentrazioni minime di 5±2 pM, paragonabile alle tecniche più
sensibili esistenti basate su biologia molecolare. (7 pubblicazioni)
c) Infine un terzo risultato degno di nota è consistito nella messa a punto e nell’utilizzo di un
sistema di microscopia con eccitazione non lineare per lo studio di comportamenti cellulari in
tessuti in vivo. Questo strumento viene utilizzato per applicazioni in ricerche di immunologia
presso lo stesso ateneo e altri istituti di ricerca. (2 pubblicazioni)
Pubblicazioni del triennio 1.10.2005-30.09.2008.
C
1. Collini, M; Caccia, M; Chirico, G, et al. Two-photon fluorescence cross-correlation spectroscopy
as
a
potential
tool
for
high-throughput
screening
of
DNA
repair
activity
Nucleic Acids Research 33, Article Number: E165, 2005. (b)
2. Unfolding time distribution of GFP by single molecule fluorescence Spectroscopy. Chirico, G;
Cannone, F; Diaspro, A Eur. Biophys. J. 35, 663-674, 2006. (a)
3. Quenching and blinking of fluorescence of a single dye molecule bound to gold nanoparticles,
Cannone, Chirico, G. Bizzarri, Cannistraro, S; J. Phys. Chem. B. 110, 16491-16498, 2006. (b)
4. Enhanced Green Fluorescent Protein (GFP) fluorescence after polyelectrolyte caging. Diaspro,
A, Krol, S, Campanini, B, Cannone, F Chirico, G. OPTICS EXPRESS 14, 9815-9824, 2006. (b)
5. Evidence of discrete substates and unfolding pathways in green fluorescent protein; Baldini, G;
Cannone, F; Chirico, G; Collini, M; Campanini, B; Bettati, S;Mozzarelli, A. Biophys. J., 92,
1724-1731, 2007. (a)
6. GFP-mut2 proteins in trehalose-water matrixes: Spatially heterogeneous protein-water-sugar
structures. D'Alfonso, L, Collini, M, Cannone, F, Chirico, G, Campanini, B Cottone, G, Cordone,
L. Biophys. J. , 93, 284-293, 2007. (a)
7. Voltage regulation of single green fluorescent protein mutants; Cannone, F; Milani, R; Chirico,
G; Diaspro, A; Krol, S; Campanini, B. Biophys. Chem., 125, 368-374, 2007. (b)
8. Environment effects on the oscillatory unfolding kinetics of GFP; Cannone, F; Collini, M; Chirico,
G; Baldini, G; Bettati; Campanini; Mozzarelli, A. Eur. Biophys. J. 36, 795-803, 2007. (a)
9. Voltage regulation of fluorescence emission of single dyes bound to gold nanoparticles;
Cannone, F; Collini, M; D'Alfonso, L; Baldini, G;Chirico, G; Tallarida, G; Pallavicini, P. NANO
LETTERS 7, 1070-1075, 2007. (b)
10. Indovina P., Collini M., Chirico G., Santini M.T., “Three-dimensional cell organization leads to
almost immediate HRE activity as demonstrated by molecular imaging of MG-63 spheroids
using two-photon excitation microscopy”, FEBS letters, 581, 719 – 726, 2007. (c)
11. Caccia M.; Sironi L.; Collini M.; Chirico G.; Zanoni I.; Granucci G., Image Filtering for Twophoton Deep Imaging of Lymphonodes., Eur. Biophys. J., 37: 979–987, 2008. (c )
12. Bosisio C., V. Quercioli, M. Collini, L. D’Alfonso, G. Baldini, S. Bettati, B. Campanini, S. Raboni,
and G. Chirico, J.Phys.Chem.B. Protonation and Conformational Dynamics of GFP Mutants by
Two-Photon Excitation Fluorescence Correlation Spectroscopy. 2008; 112: 8806‐8814. (a)
13. Pallavicini P., Chirico, G., Collini,M.; D’Alfonso, L.; Denat, F.; Diaz-Fernandez, Y-A.; Pasotti, L.;
Rousselin, Y. and Sok, N. 2008. Micelles as containers for self-assembled nanodevices:
simultaneous evaluation of the lipophilicity and acidity constants of fatty acids through
fluorescence. ChemPhysChem. 2008, 9, 1729 – 1737. (b)
14. Krol, S., Cannone, F.; Caccia, M.; Sironi, L.; Campanini, B.; Collini, M.; Chirico, G.; Diaspro A.;
J. Biophotonics. 2008. Structural Stability of Green Fluorescent Proteins Entrapped in
Polyelectrolyte Nanocapsules. 1, 310-319, 2008. (b)
D
Finanziamenti/collaborazioni del triennio 2005-2008.
Le ricerche di G.C. sono state finanziate da vari progetti di ricerca in ambito
ministeriale, di ateneo, di fondazioni bancarie ed europeo.
Progetti di Ricerca Finanziati nel triennio 2005-2008:
2. Fondo Grandi Attrezzature di Ateneo, 2005: Microscopio con eccitazione non
lineare per applicazioni biofisiche e biomediche
P.I.: G. Chirico (440 k€).
3. Progetto PRIN anno 2006 (2006027587): Studi di Cinetica di legame tramite
Fluorescenza di Singola Molecola per rilevazione ad alta sensibilita' in Medicina e
Biologia
P.I. G. Chirico (100 k€).
4. Progetto Fondazione Cariplo (2005-1079): Costruzione e lettura di reticoli di
molecole fluorescenti per mezzo di microscopia a forza atomica: un passo verso
le memorie ottiche molecolari
P.I. G. Chirico (140 k€).
Progetto Europeo VII P.Q. ENCITE (2008-2012): European Network for Cell
Imaging and Tracking Expertise.
Co P.I. Granucci/Chirico (480 k€).
G.C. è responsabile di una grande attrezzatura (Spettroscopio per Micro-Imaging
con Eccitazione Non Lineare) assegnata nell’anno 2005 ed è membro del Collegio
dei Docenti della Scuola di Dottorato in Fisica e Astronomia presso questo Ateneo.
Collaborazioni
Università di Genova: Microscopia a due fotoni;
University of Illinois at Urbana-Champaign:
Fluorescenza a due fotoni;
CNR e Università di Verona: Folding di proteine globulari;
Istituto Superiore di Sanità, Roma: Dinamica di
frammenti di DNA in soluzione;
Università di Palermo: proprietà proteine in trealosio.
Università di Heidelberg: Plasmidi di DNA;
Università di Milano - Bicocca, Dip. di Biotecnologie
e Bioscienze: Immunologia;
Istituto Superiore di Sanità, Roma:
Caratterizzazioni di metastasi tumorali;
University of Washington at Seattle: NMR di peptidi
e RNA;
Università di Parma: Unfolding di mutanti della GFP;
E
Selezione di presentazione a Congressi e Scuole.
Presentazioni su invito.
1. Convegno Nazionale della Società di fotobiologia, Firenze, Maggio 2008; G. Chirico, In Vivo Correlation
Microscopy Methods.
2. Congresso Nazionale della società Italiana di Biofisica, SIBPA, settembre 2008, Roma. Gold ColloidsFluorophore Complexes as Protein-Protein Recognition Assays, S. Freddi, M. Collini., L. D’alfonso, G.Chirico.
3. 36th Course of INTERNATIONAL SCHOOL OF BIOPHYSICS (Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy
towards Nanoscopy,) 2008, G. Chirico. Fluctuation Spectroscopy for biological Tissues.
4. Workshop, Leiden, April, 2007. G. Chirico. “Tracking single gfp proteins through unfolding pathways”, in “Theory,
Modeling and Evaluation of Single Molecule Measurements”.
5. XI SCHOOL OF PURE AND APPLIED BIOPHYSICS, Venice, ‐ Campo Santo Stefano, January 29 ‐ February 2,
2007. G. Chirico. Single Molecule Spectroscopy: principles and applications.
6. Nano2006, San Sebastian, September 2006. Voltage Regulation
of Single Molecule Fluorescence. G.
Chirico, M.Collini, F. Cannone, L. D’Alfonso, G. Baldini.
Presentazioni a congresso.
1. Palermo, SIBPA, 2006. L.D’Alfonso, M.Collini, F.Cannone, G.Chirico, G.Baldini, B.Campanini, G.Cottone,
L.Cordone, “Inhomogeneous Protein-Water-Sugar Structures of Single GFP-mut2 Proteins Caged in
Trehalose-Water Matrixes”, SIBPA, XVIII Congresso, Palermo, September, 17-21 2006.
2. Bosisio C., Quercioli V., Collini M., D'Alfonso L., Baldini G., Chirico G., Bettati S., Mozzarelli B., Campanini
B.”Protonation and structural dynamics of GFP mutants at thermodynamic equilibrium by fluorescence
correlation spectroscopy.” XCIV Congresso Nazionale, Società Italiana di Fisica Genova, 22-27 Settembre,
2008.
3. New Frontiers in Micro and Nano Photonics 23 - 26 April 2008, Florence (Italy). “Protonation and Structural
Dynamics of GFP Mutants at Thermodynamic Equilibrium by Fluorescence Correlation Spectroscopy.”, C.
Bosisio, V. Quercioli, M. Collini, L. D’Alfonso, G. Baldini and G. Chirico.
Poster presentati a congressi.
1. Chirico, S. Freddi, L.D’alfonso, M. Collini, G.Tallarida, S. Caprioli. Characterization of gold colloids‐
fluorophore complexes for protein‐protein recognition assays. Nanotech Northern Europe 2008.
Copenhagen, September, 2008.
2. Pioselli, Campanini, Raboni, Bettati, Bosisio, Chirico, Collini, Baldini, Mozzarelli. “Towards an understanding
of protein structural heterogeneity: which is the biological significance of conformational substates in
GFPmut2?” INBB (ISTITUTO NAZIONALE DI BIOSTRUTTURE E BIOSISTEMI) 2008, Roma
3. Marquezin C.A., A.S.Ito, M.Caccia, L.D’Alfonso, G.Chirico, “Espectroscopia de Correlação de Fluorescência e
Microscopia de Fluorescência: um Estudo com Excitação a Dois Fótons”, XXX Encontro Nacional de Física da Matéria
Condensada, São Lourenço, May, 7-11 2007.
4. Chirico, G; Cannone, F; Baldini, G, et al. Discrete substates and unfolding pathways of GFP during unfolding.
Conference Information: 51st Annual Meeting of the Biophysical-Society, 2007 Baltimore MD.
5. D’Alfonso, Collini, Chirico, Baldini, Campanini, Cottone, Cordone, “GFP-mut2 Proteins in Trehalose-Water
Matrixes: Spatially Heterogeneous Protein-Water-Sugar Structures”,6th European Biophysics Congress,
EBSA, London, July, 14-18 2007.
6. Quercioli V., C.Bosisio , M.Collini, “Fluorescence brightness and stability dependence of single dyes on the
nano-environment”, 6th European Biophysics Congress, EBSA, London, 2007.
7. Quercioli V., C. Bosisio, M. Collini, L.D’Alfosno, G. Chirico, “Emission enhancement of a gfp-mut2 mutant
under modulated dual color laser excitation” SIBPA, Roma 2008.
F
Didattica di G.Chirico nel triennio 2005-2008
In ognuno dei tre anni accademici di questo triennio G.C. ha tenuto i seguenti corsi
1.
2.
3.
4.
5.
Elementi di Biofisica e Fisica Medica (5 cfu). Laurea Triennale in Fisica e Astrofisica
Complementi di Biofisica e Fisica Medica (4 cfu). Laurea Triennale in Fisica e Astrofisica
Ottica Applicata (5 cfu). Laurea Specialistica in Fisica
Nanotecnologie per i biosistemi (5 cfu). Laurea Specialistica in Fisica
Complementi di Nanotecnologie per i biosistemi (1 cfu) per la Laurea Specialistica di Astrofisica
e Fisica dello Spazio.
G.C. ha inoltre avuto come insegnamenti aggiuntivi:
1. Complementi di Fisica per la laurea Triennale in Scienze della Formazione Primaria (facoltà di
Scienze della formazione, Università di Milano Bicocca, 5 cfu)
2. Fisica per il corso di Laurea di Biotecnologie Mediche presso la Facoltà di Medicina e Chirurgia
dell’Università Vita e Salute, Ospedale San Raffaele (Milano), solo per gli anni accademici 2006-2007
e 2007-2008.
Tesi.
Laurea.G.C. ha supervisionato numerosi stage per la prova finale in Fisica ed è stato relatore di
Lauree Specialistiche in Fisica. Alcune delle tesi di L.S. in Fisica di cui è stato relatore:
• Salvatore Di Stefano. AA 2005/2006. Realizzazione di un apparato interferometrico
per la misura della sezione d'urto di assorbimento non lineare di molecole
fluorescenti.
• Aurora Panzera AA 2006/2007. Study of biomimetic lipid systems through optical
microscopy
and
spectroscopy
Stefano Daglio AA 2007/2008 In‐Vivo Non‐Linear Microscopy.
• Laura Sironi AA 2005/2006. STUDI DI POLARIZZAZIONE DEL EGNALE DI SECONDA
ARMONICA IN TESSUTI BIOLOGICI.
• Chiara Bosisio AA 2004/2005 spettroscopia di fluorescenza risolta nel tempo
applicata ad imaging cellulare.
• Luca Mariani AA 2004/2005 Spettroscopia di correlazione di fluorescenza applicata
alle biomolecole.
Dottorato.
G.C. è stato inoltre tutore di tesi di dottorato:
1. F. Cannone, Single Molecule Spectroscopy of GFP mutants. 2005.
2. M. Caccia, Non linear Microscopy of biological tissues. 2006
3. G.C. è attualmente tutore della Dr.ssa V. Quercioli che sosterrà l’esame finale in novembre 2008
con un titolo: Fluorescence Correlation Spectroscopy of GFP mutants.