Corso di BIOTECNOLOGIE VEGETALI
I n t r o d u z i o n e a l l e B i o t e c n o l o g i e 2 parte
A cura di
Pierdomenico Perata & Elena Loreti
I GENI sono alla base delle Biotecnologie
Trasformazione
Metodi principali
di cellule in coltura
electroporation
in planta
Agrobacterium tumefaciens
tecnica bio -balistica
1
Trasformazione di cellule in coltura
PROTOPLASTI
CELLULE IN COLTURA
ELECTROPORATION
CALLO
RIGENERAZIONE
Trasformazione
in planta
Trasformazione
in planta
Tumori causati da Agrobacterium tumefaciens
2
Trasformazione
sintesi
sintesi
opine
opine
sintesi
sintesi
citochinine
citochinine
sintesi
sintesi
auxine
auxine
in planta
RB
RB
coniugazione
coniugazione
T-DNA
T-DNA
Plasmide Ti
catabolismo
catabolismo
opine
opine
LB
LB
Ori
Ori
regione
regione
vir
vir
Trasformazione
Marker
Marker di
di selezione
selezione
vegetale
vegetale
Agrobacteriumtumefaciens
Agrobacteriumtumefaciens
in planta
regione
regione T-DNA
T-DNA
rimossa
rimossa
RB
RB
gene
gene di
di
interesse
interesse
Vettore binario
Plasmide Ti
helper
LB
LB
marker
marker di
di
Regione
selezione
selezione Regione
Ori
Ori
vir
vir
batterico
batterico
Ori
Ori
Ori
Ori
E.coli
E.coli
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Agrobacterium
Trasformazione
in planta
3
Trasformazione
in planta
Trasformazione
in planta
Trasformazione
in planta
4
Trasformazione
in planta
Screening per l’individuazione delle plantule trasformate
Trasformazione
in planta
Screening per l’individuazione delle plantule trasformate
Trasformazione
in planta
gene
gene di
di resitenza
resitenza
all’antibiotico
all’antibiotico
RB
RB
gene
gene di
di
interesse
interesse
Vettore binario
LB
LB
marker
marker di
di
selezione
selezione
Ori
Ori
batterico
batterico
Ori
Ori
E.coli
E.coli
Agrobacterium
Agrobacterium
5
Trasformazione
in planta
METODI DI SELEZIONE: antibiotici
Non trasformato:
Antibiotico
Tossicità
Trasformato:
Antibiotico
Gene resistenza
Trasformazione
Resistenza
in planta
METODI DI SELEZIONE: antibiotici
Gene di resistenza ad antibiotici piu’ usato:
Neomycin phosphotransferase (NPTII)
Problematiche connesse:
Trasferimento resistenza a microrganismi intestinali
Non esistono evidenze sperimentali a supporto
L’eventuale microrganismo resistente non si diffonderebbe in
assenza di continua pressione selettiva (antibiotico)
Se avvenisse: scarso impatto, già esistono numerose
popolazioni di microrganismi resistenti a questi antibiotici
Promotore vegetale, non funzionerebbe in batteri
Proteina NPT prodotta dalla pianta rapidamente degradata
nell’intestino;
Cofattori necessari al funzionamento di NPT assenti in
giusta concentrazione
Kanamicina e Neomicina sono scarsamente usati in medicina
Trasformazione
in planta
METODI DI SELEZIONE: mannosio
Non trasformato:
ATP ADP
Mannosio
HXK
M6P
M6P
M6P
M6P M6P M6P
M6P
M6P
Tossicità da
carenza di P
Trasformato:
ATP ADP
Mannosio
M6P
HXK
F6P
Glicolisi
MPI
6
Trasformazione
in planta
METODI DI SELEZIONE: resistenza a erbicidi
Preferiti agli antibiotici: maggior tossicità
inserimento carattere agronomicamente utile
Il gene Bar (da Streptomyces hygroscopicus) conferisce resistenza agli
erbicidi a base di Phosphynothricin:
Basta (registered in Europe)
Bialaphos (registered in Japan)
Ignite (registered in the USA).
La proteina Bar inattiva la Phosphynothricin aggiungendole un gr uppo
acetile preso dal Acetyl-CoA
Problematiche:
Piante resistenti a erbicidi possono indurre l’agricoltore ad un maggior
uso di erbicidi (maggiori residui nei prodotti alimentari)
Sviluppo di piante resistenti in seguito all’eccessivo uso di diserbanti
Costrutto genico
PROMOTORE
REGIONE CODIFICANTE
TERMINATORE
TRASCRIZIONE
5’
mRNA
AAAAAAA
3’
TRADUZIONE
PROTEINA
Costrutto genico
PROMOTORE
TERMINATORE
REGIONE CODIFICANTE
GENOMA
TRASFORMAZIONE
(INSERIMENTO TRANSGENE
NEL GENOMA)
L’INSERZIONE DEL TRANSGENE PUO’ INTERROMPERE LA
SEQUENZA DI UN GENE DELLA PIANTA RICEVENTE
7
Costrutto genico
TIPOLOGIE DI PROMOTORE
COSTITUTIVO: GARANTISCE UNA ELEVATA ESPRESSIONE IN TUTTI
I TESSUTI DELLA PIANTA A TUTTI I SUOI STADI DI SVILUPPO
ESEMPIO: PROMOTORE 35S DEL VIRUS del MOSAICO DEL TABACCO
(CaMV)
TESSUTO SPECIFICO: GARANTISCE L’ ESPRESSIONE IN ALCUNI
TESSUTI DELLA PIANTA
ESEMPIO: PROMOTORE PEP-CARBOSSILASI, ESPRESSO IN FOGLIE
DI PIANTE A FOTOSINTESI C4
TESSUTO -TEMPO SPECIFICO:
GARANTISCE L’ ESPRESSIONE IN
ALCUNI TESSUTI DELLA PIANTA AD UNO SPECIFICO STADIO DI
SVILUPPO
ESEMPIO: PROMOTORE LEA (Late Embyogenesis A bundant),
ESPRESSO IN EMBRIONI ALLO STADIO TERMINALE DI SVILUPPO
INDUCIBILI:
GARANTISCE L’ ESPRESSIONE IN RISPOSTA AD UN
TRATTAMENTO CHIMICO
ESEMPIO: PROMOTORE INDUCIBILE DA ANTIBIOTICI
Trasformazione
in planta
Controllo inserzione del transgene
Trasformazione
in planta
Controllo inserzione del transgene
8
Annealing a 55°
Denaturazione a 95°
PCR
PCR
Trasformazione
in planta
Controllo inserzione del transgene
genoma pianta
CaMV35S
gene di interesse
T-nos
genoma pianta
9
Trasformazione
in planta
Controllo inserzione del transgene
CTRL
1
2
T1 -1
3
4
5
6
T1 -2
7
8
9
10 11 12
2072
1500
T1 -2
13 14 15 16
17 18 19 20 21 22 23 24
2072
1500
Trasformazione
in planta
Controllo espressione del transgene
tramite Northern Blot
wt
wt
tr
Trasformazione
tr
metodo biolistico
PROIETTILI DNA-COATED
VUOTO
GAS
...
....
.......
...........
MATERIALE VEGETALE
10
Trasformazione
metodo biolistico
Trasformazione
metodo biolistico
Trasformazione
metodo biolistico
Trasformazione di genoma del cloroplasto
11
Trasformazione di genoma del cloroplasto
VANTAGGI
I GENI CLOROPLASTICI NON SONO TRASMESSI MEDIANTE IL
POLLINE (MINOR RISCHIO DI FLUSSO GENICO)
ELEVATI LIVELLI DI ESPRESSIONE DEL TRANSGENE DOVUTI ALLA
PRESENZA DI MOLTI CLOROPLASTI NELLA CELLULA (CONTRO UN
SOLO NUCLEO)
IL DNA INSERITO NEL GENOMA DEL CLOROPLASTO E’ COPIATO
5.000-10.000 VOLTE (NEL NUCLEO SOLO 1-4 VOLTE)
Trasformazione
12
