Mutazioni di LRRK2
e
malattia di Parkinson
Formazione UNIVA 2013
Dott. Rosanna Colao
Dott. Maura Gallo
Lamezia Terme 09/10/2013
Malattia di Parkinson: qualche dato
epidemiologico
~ 6% soggetti con età
d’esordio < 40 anni
15.000 nuovi casi / anno
in Italia
Familiarità
75%
«una vera causa di paralisi agitante, e forse l’unica
vera causa, è l’ereditarietà»
Leroux, 1880
Nel 1949 un medico danese, Henri Mjones,
raccolse numerosi casi con aggregazione familiare
di MP, ipotizzandone l’origine genetica, a
trasmissione autosomica dominante e con
penetranza ridotta.
Negli ultimi anni, sono stati identificati numerosi geni
causativi di MP e ciò ha comportato l’aumento delle
conoscenze dei meccanismi patogenetici alla base del
processo neurodegenerativo.
Quanto sono frequenti le mutazioni LRRK2?
PD sporadico
PD familiare
Mutazioni a carico di
questo gene hanno una
penetranza variabile che è
età-dipendente dal 17% a
50 anni
all’ 85% a 70 anni
2%
5-8%
I nostri dati: pazienti
88 consecutive and unrelated patients affected by PD
according to standard diagnostic criteria
(45 F; age at onset 65.5±7.5 years (range 51-80 years);
63 sporadic and 25 familial
100 motor and cognitively healthy control subjects (mean
age 55.6 ± 12.3; MMSE 28 ± 3.7)
Valutazione clinica
UPDRS-ME
AIMS
NPI
MMSE
TC o RMN
SCINTIGRAFIA CEREBRALE DAT-SCAN
Studio genetico
Sequenziamento degli esoni del gene Park 8
Risultati: genetica
8 variazioni in eterozigosi di LRRK2 sono state
identificate in nove pazienti tra esse:
3 nuove mutazioni missense (Phe1227Leu, Gly1520Ala
e Ile2020Ser)
5 note (Ala1151Thr, IVS31+3A>G, Arg1514Gln,
Gly2019Ser, Thr2356Ile)
Nessuna delle suddette variazioni nei controlli
Frequenza delle mutazioni
20
18
16
16
14
12
10
10,2
8
8
7,9
6
4
2
2
0
familiari
sporadici
tutti
nostri dati
letteratura
Conclusioni
• LRKK2 è frequentemente mutato in MP
• Le mutazioni si associano ad un quadro clinico
indistinguibile dalla forma sporadica classica
• Nella nostra popolazione, la frequenza di mutazioni è
maggiore rispetto alle precedentemente studiate e il
sintomo di esordio più frequente è la bradicinesia
• LRRK-2 è localizzato sul
cromosoma 12q12
• 51 esoni
• 2527 aa
• 286kD
• PARK8/ «DARDARINA»
A livello tessutale
DOVE SI ESPRIME
LRRK2???
SNC:
•corteccia cerebrale,
•cervelletto,
•midollo spinale,
•putamen,
•substantia nigra
altri tessuti:
•cuore,
•rene,
•intestino,
•fegato
•leucociti periferici
Localizzazione cellulare:
•citosol
•10% sulla membrana esterna mitocondriale
•probabile coinvolgimento nel trafficking
vescicolare
LRRK-2 svolge diverse
attività:
Funzione di kinasi
(MAPKKK)
Funzione di GTP-asi
(ROC-COR)
Interazione proteina-proteina ( ANK,
LRR; WD40)
Mutazioni a carico di questo gene hanno una
penetranza variabile che è età-dipendente dal
17% a 50 anni all’ 85% a 70 anni
Le nostre mutazioni
e la loro localizzazione
Ile2020Ser
Ala1151Thr
IVS31+3A>G
Gly1520Ala
Phe1227Leu
ANK
E’ il dominio N - terminale di circa 900 amminoacidi detto anche
Ankyrin repeats: contiene 7 repeats che formano 2 eliche antiparallele
seguite da un loop a forcina. Gli ankirin repeats si ritrovano anche in
proteine batteriche oltre che in proteine eucariote.
es: proteine del citoscheletro, fattori di trascrizione, proteine segnale e
proteine di regolazione del ciclo cellulare
Leucin Rich Repeats sono 13 domini che assumono delle
conformazioni alternate β foglietto/α elica che si allineano di
fianco a formare una struttura tipo arco. Questo dominio LRR
interagisce con diverse proteine.
F1227L A1151T
La variante A1151T è già nota ma
la patogenicità è dibattuta sebbene
né noi né altri autori l’hanno
identificata nei controlli.
LRR
Il residuo 1227 è localizzato
vicino al noto 1228 e
potrebbe interferire con i
meccanismi di legame delle
proteine. L’analisi in silico
indica la variante come
"potenzialmente dannosa".
Sito legame GDP/GTP stimola
l’autofosforilazione (dominio
ROC)
ROC
3 mutazioni note a livello di
R1441 (C/G/H) che
probabilmente riducono
l’affinità di legame con GTP
COR
Mg2+
Sito catalitico GTPasico
C-terminal Of Roc: il modulo
ROC/COR è evolutivamente
conservato. E’ proprio COR il
dominio candidato ad interagire
con Parkin.
Il legame del GTP al dominio
ROC regola
Il modello ipotizzato
per lal’attività
regolazione
chinasica
dell’attività kinasica mediata da COR:
•Quando avviene il legame di con il GTP, il
ROC attivato induce dimerizzazione del
dominio COR.
•La dimerizzazione del dominio COR
inoltre induce auto-associazione del
dominio chinasico, con conseguente
autofosforilazione e attivazione.
•Mediante l'idrolisi da GTP a GDP,
avviene un cambio conformazionale nel
ROC che interrompe
il dominiol'associazione
di COR serve da
cerniera
per
trasmettere
il segnale dal
dimerica
delmolecolare
COR e del
dominio
chinasico,
dominio
inattivando la chinasi
. ROC al
dominio della chinasi attraverso cicli di legame
GTP / GDP
(Deng J et al. PNAS 2008;105:1499-1504).
Il ROC si attiva mediante legame al
GTP, una volta attivato va a
formare un «dimero» che agendo
da GTPasi (funzione di idrolisi)
regola a sua volta l’attività
chinasica.
Non abbiamo trovato mutazioni nel Roc MA nel
COR
IVS31+3A>G
R1514Q
G1520A
G1520A è una delle nuove mutazioni
identificata. L’analisi in silico suggerisce
che il cambio amminoacidico è dannoso
per la proteina e potrebbe incrementarne
l’attività kinasica.
La variante A1514Q da noi identificata è stata precedentemente
riportata da Toft et al. come un polimorfismo non patogenico
perché identificato in soggetti di controllo. Noi ipotizziamo che
sia un raro polimorfismo, almeno nella nostra coorte.
Kinasi
N-terminale
Mg2+
Sito attivo (aa
conservati
DF/YG)
Loop
di
attivazione
kinasica
Mg2
+
Dopo la fosforilazione, il segmento di attivazione
passa ad uno stato attivo che «accoglie» i substrati
avviando la catalisi enzimatica
tripeptide
APE
C-terminale
GG2019S
I2020T
G2019S e I2020T cambiano la struttura di questo dominio kinasico. Questa
mutazioni ↑ attività kinasica perchè aggiungono un nuovo potenziale sito di
fosforilazione in un dominio evolutivamente conservato (gain of function
effect).
Mutazioni al di fuori del dominio kinasico influenzano la capacità di legame
al GTP.
I2020S è la nuova variante identificata da noi
I2020S altera un residuo altamente conservato all’inizio del segmento di attivazione.
Queste sostituzioni potrebbero introdurre un nuovo sito di fosforilazione
(serina/treonina) che potrebbe a sua volta influenzare l’attività enzimatica o la
capacità della proteina di legare i substrati.
WD40
Dominio di legame per fosfo-serina e fosfotreonina. Ogni repeat contiene 4 filamenti a βfoglietto che si ripiegano a formare una specie di
piattaforma circolare.
trasduzione di segnali cellulari
processamento di mRNA
assemblaggio del citoscheletro
interazione proteina-proteina
La presenza di residui di arginina
altamente conservati, conferisce a
WD40 una netta carica +, che
consente l’interazione con ligandi
con carica - quali fosfolipidi o acidi
nucleici.
T2356I (nota e dibattuta) potrebbe alterare la struttura di questa
specie di piattaforma che lega reversibilmente diverse proteine.
LRRK2 & Neurodegenerazione:
LRRK2 mutato causa neurodegenerazione
probabilmente in due modi:
• «gain-of-toxic-function»: che può essere dovuto sia per
cattiva regolazione della normale funzione della proteina o
per l'acquisizione di una nuova funzione tossica.
• «loss of normal function»: ovvero le mutazioni
interferiscono con l’attività normale di LRRK2 agendo con
effetto dominante negativo
Greggio E and Cookson MR (2009) Leucine-rich repeat kinase 2
mutations and Parkinson’s disease: three questions. ASN NEURO 1(1).
I nostri interrogativi
Alcune mutazioni note e identificate nella
nostra casistica sono dibattute. Dato che
LRKK2 è un gene dalla penetranza incompleta
e dall’espressività variabile ci chiediamo se e
come
tali mutazioni possano essere
responsabili del quadro patologico?
Come possiamo dimostrare che queste
mutazioni sono responsabili del fenotipo
clinico che vediamo nei nostri pz?
Forse siamo state un
po’ pesanti ma….
GRAZIE per averci
ascoltate!!!!
