Presentazione di PowerPoint

Epidermolisi bollose ereditarie:
aspetti genetici
Daniele Castiglia
Istituto Dermopatico dell'Immacolata
Roma
Mutazioni in 18 differenti geni causano l’EB
Analisi molecolare: ragioni per raccomandarla
• Identificazione delle basi molecolari specifiche,
con implicazioni per la prognosi.
• Counseling genetico accurato sulle modalità di
trasmissione e sul rischio riproduttivo.
• Diagnosi prenatale “DNA-based” nel primo
trimestre nelle famiglie a rischio riproduttivo.
• Prerequisito per futuri interventi terapeutici
basati su “gene or protein replacement”, o altre
modalità di trattamento (cell-based).
EBG-gen-sev
IF: marcaggio negativo per LM-332
labelling
Bambini EB da genitori sani presentanti bolle generalizzate alla nascita
EBDR-gen-sev
IF: marcaggio negativo per
collagen VII
labelling
Diagnostica molecolare nelle EB ereditarie
Disease
EBS
JEB
DEB
Kindler syndrome
Gene
Exon (#)
cDNA length (bp)
Technique
TGM5
13
2777
DNA amp > Seq
DSP
24
2871
DNA amp > Seq
PKP1
15
5447
DNA amp > Seq
JUP
15
3400
DNA amp > Seq
KRT5
8
2164
DNA amp > Seq
KRT14
8
1377
DNA amp > Seq
EXPH5
6
5971
DNA amp > Seq
PLEC
32
13722
DNA amp > Seq
DST (BPAG1-e)
24
7950
DNA amp > Seq
LAMA3
38
5142
DNA amp > heteroduplex scanning> Seq
LAMB3
23
3518
DNA amp > heteroduplex scanning> Seq
LAMC2
23
3581
DNA amp > heteroduplex scanning> Seq
COL17A1
56
4493
DNA amp > heteroduplex scanning> Seq
ITGB4
41
5468
DNA amp > heteroduplex scanning> Seq
ITGA6
26
3821
DNA amp > Seq
ITGA3
26
3156
DNA amp > Seq
COL7A1
118
9300
DNA amp > heteroduplex scanning> Seq
FERMT1 (KIND1)
15
4931
DNA amp > Seq
Screening genetico: l’esempio del COL7A1
1
118
• Sequenziamento Sanger: efficiente (94.8%), ma costoso.
• Denaturing-HPLC: efficiente (97%), semi-automatico, ad alta
processività.
• Sequenziamento parallelo massivo (whole exome capture)
: strategia diagnostica efficiente e complementare quando i
metodi classici falliscono. Sono necessari una piattaforma
diagnostica appropriata e un supporto bioinformatico.
• Sequenziamento parallelo massivo (pannello EB):
XomeDxSlice, (include 28 geni di interesse), disponibile alla
GeneDx (Gaithersburg, MD, USA) al prezzo di US $3,000 per
campione. In Italia, messo a punto un pannello EB con 34
geni dall’Università di Modena Reggio Emilia (Tenedini et al.,
Br J Dermatol 173:731-8, 2015).
Profili DHPLC delle mutazioni ricorrenti in
COL7A1 nella popolazione italiana
Ex 4
62.1°C
497insA
Ex 54
61.2°C
Ex 109
60.8°C
Ex 95 62.3°C
In 49
G1664A
8074delG
7344G>A
4783-1G>A
63.5°C
Ex 3
62.1°C
425A>G
Ex 54
61.2°C
WT
Ex 3/4
62.1°C
Ex 109/110 60.8°C
WT
Ex 94/95
62.3°C
Ex 49/50
63.5°C
WT
WT
WT
Nell’insieme le mutazioni ricorrenti rappresentano il 34% degli alleli COL7A1
mutati in pazienti Italiani
Castiglia & Zambruno Dermatol Clin, 2010
Mutazioni ricorrenti in pazienti con EB
Epidermolisi bollosa giunzionale generalizzata
grave (Herlitz) in Italia (deficit di laminina-332)
• 31 famiglie geneticamente caratterizzate dal
1996 a tutt’oggi (3 nel corrente anno)
• Eseguite 16 diagnosi prenatali (villocentesi) (in
collaborazione con Istituto Mendel, Roma)
• Frequenza del portatore: 1/375
• Rischio riproduttivo del portatore (coppia nonconsanguinea): 1/1500
Castori et al., Br J Dermatol, 2008
Altri casi in cui individui affetti da
EB e le loro famiglie possono
beneficiare dell’analisi genetica
Il caso della disomia uniparentale
Omozigote per la mutazione
c.1945dupG in LAMB3
Eterozigote per la mutazione
c.1945dupG in LAMB3
Sequenza normale.
Nessuna mutazione
rilevata
La caratterizzazione di SNPs e sequenze
microsatelliti sul cromosoma 1 dimostra che il
probando è omozigote per l’aplotipo materno
Riduzione
all’omozigosità per la
c.1945dupG a causa
dell’isodisomia materna
Rischio riproduttivo
trascurabile (< 1%)
Stretta correlazione fenotipo-genotipo:
bolle e pigmentation mottled (I)
EBS-MP
Il test genetico
rappresenta il
miglior supporto
per la diagnosi
KRT5
p.P25L
Stretta correlazione fenotipo-genotipo:
bolle ed eritema circinato migrante (II)
EBS-MCE
KRT5 c.1649delG
Castiglia et al. Acta Derm Venereol, 2014
Epidermolisi bollosa distrofica
• Causata da mutazioni nel gene COL7A1,
codificante il collagene di tipo VII
•Trasmessa con modalità autosomica dominante
(DDEB) o recessiva (RDEB)
• Caratterizzata da:
- bolle cutanee e mucose
- ferite croniche
- tessuto cicatriziale e fibrosi
- unghie distrofiche o assenti
- alopecia cicatriziale
- pseudosindattilia
- sviluppo di cancro squamocellulare
Alta variabilità fenotipica
RDEB nails only
RDEB-no
C7
RDEB-gs
RDEB gen-sev
C7
La quantità di collagene VII nella cute è il miglior
indicatore del fenotipo EBD
Correlazione genotipo-fenotipo:
•Mutazioni troncanti su entrambi gli alleli di COL7A1
usualmente causano le forme generalizzate gravi di RDEB
(RDEB sev-gen, anche detta Hallopeau-Siemens RDEB)
•L’eterozigosi composta di mutazione troncante e mutazione
“missense” o di splicing in COL7A1 sono frequentemente
associate con forme miti o moderate di RDEB (RDEB-geninterm, anche dette non-Hallopeau- Siemens RDEB)
•Mutazioni dominanti di tipo “missense”, per la maggior parte
rappresentate da sostituzioni di residui di glicina, alterano la
stabilità del collagene e la formazione delle fibrille di
ancoraggio, causando fenotipi miti-moderati di EBD
Numerose osservazioni indicano che pazienti RDEB con lo
stesso corredo di mutazioni in COL7A1 e/o livelli simili di
espressione di collagene VII possono avere manifestazioni
cliniche differenti (variabilità fenotipica inter- and intrafamiliare)
Geni modificatori
Discordanza fenotipica nei gemelli monozigoti
Twin S (severe)
Twin M (mild)
Odorisio et al, Hum Mol Genet 2014; 23:3907
La quantità di collagene VII (C7) nella cute dei
due gemelli è all’incirca paragonabile
I fibroblasti del gemello più grave (S) manifestano
un fenotipo profibrotico e proinfiammatorio
I gemelli monozigoti (MZ) discordanti per il
fenotipo sono un modello ideale per esaminare
le differenze nelle attività dei geni
gemelli
“identici”
sono
sovrapponibili
per
maggior
I
la
perfettamente
parte
delle
caratteristiche genetiche e non-genetiche come età,
sesso e influenze ambientali precoci, quindi le
differenze nell’attività dei geni possono essere
direttamente correlate con il fenotipo.
Geni coinvolti nel regolare l’attività del TGF-β
sono differenzialmente espressi nei fibroblasti dei
gemelli
Severe versus mild
L’incorporazione di decorina nella cute del
gemello con fenotipo meno grave (M) è maggiore
S
M
DAPI
Fluorescence intensity
Decorin
S
M
La somministrazione di decorina contrasta il
fenotipo contrattile profibrotico dei fibroblasti
del gemello più grave
L’attività del TGF-β sembra avere una forte
influenza sulla patogenesi dell’RDEB nel
modello murino
• Aumentata infiammazione
• Fibrosi dermica mediata dal
TGF-β
• Riparo della ferita difettivo
Fritsch et al, J Clin Invest 2008
Nyström et al, J Clin Invest 2013
Nyström et al, EMBO Mol Med 2015
Conclusioni
• La quantità di collagene VII non è l’unico indice
di gravità di malattia
• La differente attività del TGF-β si associa a
differenze del fenotipo in individui
geneticamente identici (controllo epigenetico?)
• Livelli costitutivi di decorina possono mitigare
il fenotipo profibrotico e proinfiammatorio dei
pazienti con RDEB contrastando l’attività del
TGF-β