Cap. 21 - Ateneonline

Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl
Capitolo 21 Trasposizione
PER IL RIPASSO
1. Fai riferimento alla Figura 21.1. Stanley Cohen clonò un trasposone batterico in un plasmide,
quindi separò i filamenti del DNA ricombinante e li fece ri-appaiare. In presenza di ripetizioni
invertite all’interno dei DNA a singolo filamento, si formerebbero appaiamenti intramolecolari di
basi, dando luogo a una struttura a forcina con un gambo. In effetti, Cohen riscontrò queste
strutture al microscopio elettronico.
2. IS1 possiede corte ripetizioni invertite alle sue estremità. Contiene solo due geni, che
codificano per la sua trasposasi. Tn3 (Figura 21.4) possiede anch’esso ripetizioni invertite alle
sue estremità, e due geni (tnpA e tnpR), che catalizzano la trasposizione. In aggiunta, contiene il
gene bla, che codifica per la beta-lattamasi, che conferisce resistenza all’ampicillina. Ac (Figura
21.10) contiene (imperfette) ripetizioni terminali invertite, ed un gene di trasposasi.
3. Fai riferimento alle Figure 21.5 e 21.6.
4. Fai riferimento alla Figure 21.7.
5. Fai riferimento alla Figura 21.9. Il colore viola nei chicchi deriva dal pigmento prodotto dal
gene C (color). I chicchi bianchi si formano quando un trasposone Ds si pone nel gene C,
inattivandolo. Le macchie viola si ritrovano nella progenie di cellule di un chicco bianco in via di
formazione, in cui la trasposasi di Ac ha fatto trasporre fuori del gene C un trasposone Ds,
riattivando il gene. Quando questi fenomeni si verificano precocemente nello sviluppo del
chicco, il numero di cellule con un gene C riattivato è grande, cosicché le macchie viola sono
estese. In maniera complementare, quando questi eventi si verificano tardi nello sviluppo del
chicco, le macchie viola sono piccole.
6. Fai riferimento alla Figura 21.11.
7. I geni embrionali delle catene L ed H degli anticorpi sono modulari, con regioni variabili e
costanti separate. Le regioni variabili delle catene L sono codificate dai due moduli V e J, mentre
le regioni variabili delle catene H sono codificate da tre moduli, V, D e J. Esistono molti diversi
moduli V, e parecchi moduli D e J. Durante lo sviluppo di una cellula B in grado di produrre
anticorpi, questi moduli si arrangiano in maniera casuale, generando molte diverse combinazioni
sia nelle catene L che nelle catene H. Il numero di diverse combinazioni è il prodotto del numero
di moduli di ciascun tipo. La specificità dell’anticorpo è determinata dalle catene H ed L,
cosicché il numero di diverse specificità è il prodotto del numero di diverse catene H ed L. In
aggiunta alla variabilità è il fatto che il meccanismo di unione dei moduli durante lo sviluppo
cellulare è impreciso, cosicché si perdono o si acquistano nucleotidi, il che cambia la codifica del
gene. Infine, i geni degli anticorpi sono soggetti a ipermutazione, durante lo sviluppo delle
cellule B. Ciò a causa dell’induzione della citidina deaminasi durante lo sviluppo, un enzima che
deammina le citosine nei geni anticorpali riarrangiati, generando nucleosidi uridilici. Le uridine
possono essere rimosse dal riparo di accoppiamenti errati, che può introdurre mutazioni, oppure
possono essere rimosse e determinare attività di riparo soggetto ad errori. Questo processo
introduce mutazioni, generando uulteriore diversità. Il risultato netto di tutti questi fattori è che
qualche migliaio (o anche meno) di geni (o, più correttamente, moduli) di immunoglobuline
possono dar luogo a miliardi di diversi anticorpi.
8. Fai riferimento alle Figure 21.12 e 21.13.
9. Fai riferimento alla Figura 21.14. I moduli V, D e J nei geni embrionali delle
immunoglobuline sono fiancheggiati da sequenze segnale di ricombinazione, chiamate segnali
12 e segnali 23. In un gene embrionale di catene leggere, i moduli V hanno segnali 23 ed i
moduli J hanno segnali 12, o i moduli V hanno segnali 12 ed i moduli J hanno segnali 23. Nei
geni embrionali delle catene pesanti, i moduli V e J hanno segnali 23, e i moduli D hanno segnali
12. La ricombinazione tra questi moduli segue la regola 12/23, che implica che un segnale 23
può unirsi ad un segnale 12, o viceversa. Quindi, prevenendo l’unione tra segnali 12 o tra segnali
23, la cellula assicura che solo uno, ed uno solo, di ciascun modulo, sia presente nel gene finale
riarrangiato.
10. Fai riferimento alla Figura 21.15. Questo plasmide contiene un promotore lac, un terminatore
della trascrizione batterico fiancheggiato da un segnale 12 ed un segnale 13, ed infine un gene
reporter cat. Il plasmide è mutagenizzato, quindi introdotto in cellule eucariotiche, dove il
riarrangiamento può verificarsi, o meno. Se si verifica, il terminatore della trascrizione è rimosso
o invertito, cosicché l’espressione di cat, sotto il controllo del promotore lac, può avvenire nelle
cellule batteriche. Se una mutazione blocca il riarrangiamento, il terminatore rimane, e non si
osserverà espressione di cat nelle cellule batteriche. Quindi, per verificare se una mutazione ha
inattivato un segnale di ricombinazione, il plasmide è purificato da cellule pre-B, e quindi
introdotto in cellule di E. coli cresciute in presenza di cloramfenicolo. Se le cellule crescono, il
gene cat è effettivamente espresso, quindi i segnali di ricombinazione sono intatti. Se le cellule
batteriche non crescono, non si sta avendo espressione di cat, quindi i segnali di ricombinazione
sono stati inattivati da mutazioni.
11. Fai riferimento alla Figura 21.16. Questo meccanismo coinvolge la formazione di estremità a
forcina sui DNA che stanno ricombinando, che quindi si aprono in maniera imprecisa. Questa
imprecisione contribuisce alla diversità nei geni risultanti.
12. Fai riferimento alla Figura 21.17. Gellert e colleghi generarono un substrato marcato al 5’ o
con un segnale 12, o con un segnale 23, quindi incubarono questo DNA con Rag-1, Rag-2 o
entrambi, quindi sottoposero i prodotti ad elettroforesi su gel, in condizioni non-denaturanti e
denaturanti. Con il substrato del segnale 12, ad esempio, nell’elettroforesi non denaturante
compare un frammento marcato di 16 bp. Queste sono le dimensioni attese per il DNA dopo una
rottura a doppio filamento, ma non è possibile determinare da questo gel se si tratta di una
struttura a forcina o di un normale DNA a doppio filamento. Per scoprirlo, Gellert e colleghi
effettuarono elettroforesi in condizioni denaturanti, e riscontrarono un frammento di 32
nucleotidi, che è quanto ci si aspetta da una DNA a doppio filamento di 16 bp con una struttura a
forcina.
13. Baltimore incubò particelle retrovirali con un deossinucleoside trifosfato marcato e gli altri
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dNTP, non marcati, secondo varie condizioni. Quindi verificò la presenza di un prodotto di DNA
marcato mediante precipitazione acida. La Figura 21.20 mostra che qesto prodotto effettivamente
era presente, e che era fortemente ridotto da trattamenti con RNasi, specialmente quando la
reazione era pre-incubata con RNasi, che degradava lo stampo virale ad RNA.
14. Baltimore marcò prodotti di DNA strong-stop in particelle retrovirali con dTTP marcato,
qindi sottopose il prodotto marcato a ultracentrifugazione in gradiente di solfato di cesio. La
Figura 21.21a mostra un prodotto marcato, la cui densità assomiglia a quella dell’RNA (a causa
del grande stampo di RNA). Dopo riscaldamento, il prodotto marcato di DNA è stato separato
dallo stampo di RNA, e la Figura 21.21b mostra che il prodotto era molto più vicino in densità al
DNA, ma era ancora più denso del DNA, perché era presente dell’RNA legato. Dopo aver
trattato questo prodotto con RNasi e successiva ricentrifugazione (Figura 21.21c), il prodotto
aveva la densità attesa per il DNA puro. Quindi, il prodotto di DNA aveva un primer di RNA
legato.
15. Fai riferimento alla Figura 21.22.
16. Fai riferimento alla Figura 21.23. I due “salti” fanno completare le LTR nel provirus,
utilizzando entrambe le LTR virali come stampi.
17. Paragona le Figure 21.18 e 21.24. Ad eccezione dell’introne in Figura 21.24, che è stato
introdotto sperimentalmente, le due figure mostrano eventi identici. L’unica differenza è che la
replicazione del retrovirus comincia con un RNA virale, mentre la trasposizione del
retrotrasposone comincia con un trasposone di DNA a doppio filamento, che è analogo ad un
retrovirus.
18. Le seguenti evidenze supportano la retrotrasposizione (di Ty1 in particolare) attraverso un
intermedio di RNA.

Ty1 codifica per una trascrittasi inversa.

L’RNA di Ty1 e la trascrittasi inversa si trovano in particelle simil-virali nella cellula.

Si può inserire un introne in un elemento Ty1, quindi indurre trasposizione, e osservare
perdita dell’introne dopo trasposizione.

Un tRNA della cellula ospite fa da innesco per la retrotrascrizione di Ty1.
19. Eickbush e colleghi mescolarono l’endonucleasi purificata R2Bm con un plasmide
superavvolto contenente un sito per R2Bm. Ad incubazioni fino a 120 minuti, i ricercatori
prelevarono campioni e li analizzarono in elettroforesi s gel per l’introduzione di nick (attraverso
la generazione di forme circolari rilassate) o per tagli a doppio filamento (attraverso la
generazione di una forma lineare). La Figura 21.26a mostra il gel colorato, che fa vedere che a
tempi brevi di incubazione il plasmide generava forme circolari rilassate, e che a tempi più
lunghi si generavano tagli a doppio filamento, che generavano una forma lineare. La Figura
21.26b mostra la rappresentazione grafica dei dati sperimentali del pannello (a), e la Figura
21.26c mostra che in assenza del cofattore ad RNA dell’enzima si ottiene l’introduzione di nick,
ma non si generano tagli a doppio filamento.
20. Fai riferimento alla Figra 21.27. Eickbush e colleghi effettuarono una reazione in vitro su un
DNA target R2Bm con interruzioni, uno stampo ad RNA di R2Bm, endonucleasi R2Bm
purificata, e i quattro dNTP, con [32P]dATP. I ricercatori visalizzarono i prodotti marcati
mediante elettroforesi. La Figura 21.27b mostra i risultati sperimentali. Il canale 1 non mostra
prodotti in presenza di un RNA non specifico, utilizzato come stampo. Il canale 2 mostra
abbondante prodotto in presenza di R2Bm interrotto, e il prodotto (di circa 1.9 kb) è simile in
dimensioni al prodotto atteso di 1.8 kb dalla retrotrascrizione dello stampo intero. I canali 3-6
sono controlli per la specificità della reazione, e mostrano che è sensibile a due tipi di RNasi.
21. Fai riferimento alla Figura 21.28.
PER L’APPROFONDIMENTO
1. Ci saranno ripetizioni dirette di 5 bp del DNA dell’ospite fiancheggiante il trasposone. Il tuo
schema dovrebbe assomigliare a quello mostrato in Figura 21.2, tranne che per i tagli sfalsati di 5
bp, invece di 9 bp.
2. Trasferisci il plasmide contenente il trasposone Stealth in batteri con il plasmide bersaglio. Fai
avvenire la trasposizione, quindi purifica i plasmidi dai batteri e saggiali per la capacità di
conferire resistenza ad antibiotici in altri batteri. Se è avvenuta la trasposizione di Stealth nel
plasmide bersaglio, dovresti purificare un plasmide contenente geni di resistenza sia per
l’ampicillina che per il cloramfenicolo. La resistenza all’ampicillina deriva dal trasposone Stealth
e la resistenza al cloramfenicolo deriva dal plasmide bersaglio. Quindi, i batteri trasformati con il
plasmide bersaglio contenente Stealth dovrebbe essere capace di crescere in mezzo contenente
sia ampicillina che cloramfenicolo (vedi la Figura 21.3).
3.
a. In assenza di trasposasi, non si formeranno cointegrati, così i prodotti finali saranno i DNA del
donatore originale e del bersaglio; non ci saranno modifiche.
b. Senza risolvasi, si formerà un cointegrato che contiene i DNA del donatore e del bersaglio, e
siccome il cointegrato non può essere risolto, sarà il prodotto finale.
4. Come mostrato in Figura 21.5, ci saranno due copie di TnT nel cointegrato, che saranno
localizzate alle interfacce tra i due plasmidi.
5. No, la frequenza di chicchi variegati sarà molto bassa, o addirittura non osservabile. Ciò
perché Tn3 sfrutta un meccanismo replicativo, così una copia del trasposone rimarrebbe nel gene
C dopo la trasposizione, e il gene C rimarrebbe perciò inattivo.
6.
a. Inibitori della replicazione del DNA a doppia elica bloccherebbero la trasposizione di Tn3, che
utilizza il normale meccanismo semiconservativo della replicazione. Tuttavia, questi inibitori
non bloccherebbero la trasposizione di trasposoni Ty, come Ty1, perché essi si replicano
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mediante retrotrascrizione e quindi sintesi di un secondo filamento di DNA su uno stampo di
DNA a singolo filamento.
b. Inibitori della trascrizione non bloccheranno in maniera diretta la trasposizione di Tn3 perché
la trascrizione non è parte del suo ciclo di trasposizione. Tuttavia, la trasposizione di Tn3
dipende da una nuova proteina, la trasposasi, e gli inibitori della trascrizione ne bloccheranno la
produzione, impedendo perciò la trasposizione. Inibitori della trascrizione bloccheranno
direttamente la trasposizione di Ty1, perché il primo passaggio della trasposizione è la
trascrizione.
c. Inibitori della retrotrascrizione non bloccheranno la trasposizione di Tn3 perché la
retrotrascrizione non è parte del suo ciclo di trasposizione. Tuttavia questi inibitori bloccheranno
la trasposizione di Ty1 perché la retrotrascrizione è una caratteristica centrale del suo ciclo di
trasposizione.
d. Inibitori della traduzione non bloccheranno direttamente la trasposizione di Tn3 o di Ty1.
Tuttavia, entrambi i cicli di trasposizione dipendono da proteine non-cellulari (la trasposasi per
Tn3, e la trascrittasi inversa per Ty1). Quindi, inibitori della traduzione bloccherebbero la
trasposizione di entrambi i trasposoni, bloccando la sintesi di queste nuove proteine.
7. Come abbiamo appena visto nella risposta al problema 6, inibitori della replicazione del DNA
a doppio filamento e inibitori della trascrittasi inversa possono distinguere tra retrotrasposoni e
classici trasposoni basati su replicazione del DNA, come Tn3. Se Rover è un retrotrasposone, la
sua trasposizione dovrebbe essere bloccata da inibitori della trascrittasi inversa, ma non da
inibitori della replicazione del DNA. D’altra parte, se Rover è un classico trasposone del tipo
Tn3, la sua trasposizione sarà bloccata da inibitori della replicazione, ma non da inibitori della
trascrittasi inversa.