Dettagli sui terreni di coltura usati per i batteri in laboratori di microbiologia
BIO PCA AGAR SU PETRI: (PLATE COUNT AGAR)Terreno di coltura
agarizzato, pronto all'uso, specifico per la ricerca dei
batteri totali
XLD: contiene un mix di zuccheri (xilosio, lattosio, saccarosio) oltre a dei sali, all'agar per solidificare e al
rosso fenolo per verificare il cambio di pH; ci crescono Salmonella, Arizona, Edwardsiella Shigella Proteus
Escherichia, aerobacte, klebsiella, citrobacte, serratia;
Thayer Martin: contiene peptone, emoglobina, vancomicina,colistina nistatina (gli ultimi 3 sono antibiotici)
e vi crescono le Neisserie in generale;
Hektoen Entenc Agar: contiene sali biliari, fuxina acida blu di bromo timolo, salicina, ci crescono Salmonella
Shigella Providencia Pseudomonas;
Sabouraud: contiene peptone e destrosio adatto per fungi quali Candida species;
Tryptose contiene peptone, adatto per Brucella, Streptococco, altri batteri delicati o difficili da coltivare;
Mac Conkey contiene peptone, lattosio, sali biliari, rosso neutro e cristal violetto, adatto per Gram-,
Coliformi lattosio fermentanti e altri batteri non lattosio fermentanti;
Mannitol Salt Agar: contiene estratto di carne, peptone, mannitolo, rosso fenolo, ideali per tutti gli
Stafilococchi (coagulasi negativi alorne bianco, coagulasi positivi alone rosso porpora);
Columbia CNA contiene: peptone, amido, CNA antibiotic, acido nalidixico, colistina (gli ultimi 3 sono
antibiotici) adatto per Stafilococco aureus, Stafilo emoliticus, enterococco, mentre inibisce stafilo
epidermidis, micrococchi, Gram+ e -, proteus, klebsiella, pseudomonas;
Blood agar base: estratto di carne e peptone, adatto per Gram+, non è selettivo;
Chocolate Agar: contiene sangue cotto, peptone, fegato digerito, livito, indicato per Haemophilus;
Selenite Broth Base: contiene pepstone e lattosio, adatto per Salmonella tiphy e altre speci;
Malt Extract Agar: estratto di malto e peptone, adatto per lieviti e muffe;
C.L.E.D.: peptone, estratto di carne, triptone, lattosio, blu di bromofenolo, cistina, adatto per E.coli,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, Psudomonas, Strepto faecalis, Stafilo aureus, Stafilo coaug neg,
Corynebacterium, lactobacillus;
Trichomonosa Medium: tryptose soya broth, cloramfenicolo, fegato digerito, destrosio, siero di cavallo,
calcio pantotenato, specifico per Trichomonas vaginalis
Slanetz and Barley medium: triptosio, lievito, destrosio, tetrazolio cloruro, adatto per Enterococchi (stropto
gruppo D) e Stepto fecali..
TERRENI DI COLTURA
I terreni di coltura rappresentano i substrati artificiali nei quali è possibile far crescere i
microrganismi.
Devono avere determinate caratteristiche:
1. Concentrazione di sostanze nutritive adeguata alle esigenze della specie
microbica.
2. Adeguato grado di umidità.
3. pH adatto.
4. Devono essere sterili e protetti da contaminazioni.
I terreni di coltura contengono le seguenti categorie di ingredienti:
Peptoni e idrolisati: sono miscele di amminoacidi liberi e polimerizzati,
facilmente utilizzabili dalle cellule batteriche. Sono ottenuti dalla digestione
enzimatica e rappresentano la principale fonte di azoto organico.
Carboidrati: rappresentano la principale fonte di carbonio organico e possono
essere utilizzati nelle prove di identificazione basate sulla fermentazione. I
principali sono glucosio, saccarosio, lattosio.
Sali inorganici: hanno la funzione di rifornire le cellule degli elementi inorganici
essenziali, di garantire adeguata osmolarità e di tamponare il terreno.
Indicatori: sono le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo,
verde di bromo cresolo, ecc.) che permettono di seguire il metabolismo
fermentativo del batterio in esame, determinando il viraggio di colore del terreno
a valori critici di pH.
Solidificanti: la sostanza più usata per solidificare i terreni di coltura è
l'agar, un estratto di diversi generi di alghe rosse, che presenta proprietà
particolarmente idonee all'impiego in microbiologia. Esso fluidifica intorno a
96-100°C e solidifica a temperature inferiori ai 45°C. È trasparente quindi non
interferisce con le altre caratteristiche colturali, non inibisce la crescita e non
viene digerito dagli enzimi batterici.
Sostanze selettive: composti chimici la cui presenza, in concentrazioni adeguate,
risulta tossica per alcuni microrganismi, mentre è ben tollerata da altri, di cui
viene favorita la crescita.
Sostanze di arricchimento: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina,
vitamine. Queste sostanze sono necessarie per la crescita di batteri più “esigenti”
dal punto di vista nutrizionale.
Classificazione dei terreni di coltura
I terreni di coltura si distinguono in liquidi e solidi.
TERRENI LIQUIDI
Sono una semplice soluzione in acqua dei componenti nutritivi essenziali allo sviluppo
microbico e vengono chiamati anche brodi.
TERRENI SOLIDI
I più antichi sono il siero di sangue coagulato e la patata (patata glicerinata per i
micobatteri). Oggi si ricorre all'aggiunta dell'agar. I terreni solidi sono indispensabili per
l'isolamento di colture batteriche pure.
In rapporto alla composizione chimica si possono classificare in
TERRENI GENERICI
Servono alla coltivazione di batteri senza particolari esigenze nutritive (Es. "brodo
normale", o "brodo semplice"; "brodo normale solidificato con agar" o "agar semplice").
Di uso comune sono il "brodo nutritivo" e l'"agar nutritivo". Contengono peptoni,
(0,5%); estratto di carne, NaCl e tampone fosfato (pH ~ 7,0).
TERRENI SINTETICI
Contengono soltanto le sostanze organiche e inorganiche di cui il microrganismo
coltivato necessita e la loro composizione è pertanto nota.
Si utilizzano quando si conoscono tutti i fattori di crescita del microrganismo in esame.
TERRENI COMPLESSI
Si tratta di terreni ricchi di substrati organici nei quali non tutti i costituenti o le loro
quantità sono noti. Estratti di carne, di organo (brodo, fegato per anaerobi), siero di
sangue sono fra i componenti più frequenti.
In rapporto alla funzione si distinguono in
TERRENI DI ARRICCHIMENTO
Terreni poveri che consentendo la sopravvivenza ai microrganismi di una sola specie, di
fatto ne arricchiscono la popolazione a scapito di altre.
TERRENI DIFFERENZIALI
In questi terreni la presenza di particolari indicatori consente di riconoscere le singole
specie batteriche dalle caratteristiche macroscopiche delle colonie.
TERRENI SELETTIVI
Favoriscono la crescita di alcune specie ed inibiscono quella di altre. Si ottengono
mediante l'aggiunta ai terreni nutritivi di sostanze inibenti quali antibiotici, coloranti e
sali. Sono impiegati per isolare le singole specie da materiali plurimicrobici.
Tecniche di semina
Il materiale da cui partire per allestire colture microbiche può essere rappresentato da
campioni naturali, ceppi standard di riferimento, colture pure isolate. La scelta delle
tecniche di prelievo, dell'inoculo e di semina successiva è determinata dalle condizioni in
cui si presenta il campione e dallo scopo per cui vengono predisposte le varie colture.
Comunque qualsiasi sia il tipo di procedura adottata, questa deve essere condotta in
condizioni di sterilità per evitare contaminazioni di microrganismi provenienti
dall'ambiente.
L'inclusione consiste nel trasferimento di volumi precisi di campioni liquidi nelle piastre
Petri. Successivamente vengono riempite con un terreno agarizzato che determina
l'intrappolamento delle singole cellule nel terreno. Ogni cellula, moltiplicandosi, origina
una popolazione di cellule visibile ad occhio nudo, indicata con il termine colonia.
Le colonie singole vengono ottenute anche mediante semina per striscio. In questo caso
si utlizzano piastre contenenti un terreno già solidificato. Il prelievo dell'inoculo viene
effettuato con l'ansa. Prima di effettuare il prelievo l'ansa viene sterilizzata sul bunsen e
fatta raffreddare asetticamente per non rischiare di uccidere i microrganismi dell'inoculo.
La semina va effettuata con l'ansa strisciandola delicatamente sul terreno della piastra
con movimenti a zig zag.
La tecnica di semina per infissione si utilizza, mediante ago, per inoculare i terreni
solidificati in provetta. L'ago consente di inserire le cellule batteriche lungo la linea
verticale, in profondità e quindi permette lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorisce
l'osservazione delle forme mobili che manifestano una crescita diffusa a partire dalla
linea dell'inoculo.
Incubazione
Processo che consente di operare in condizioni costanti e controllate di temperatura e di
pressione. L'incubazione dei batteri aerobi e anaerobi facoltativi si realizza per mezzo
dell'impiego di armadi termostatici o di bagnomaria termoregolati. In entrambi i casi
possono essere garantite la temperatura ottimale di crescita e l'ossigenazione delle
colture.
Per gli anaerobi obbligati che non solo non crescono in presenza di ossigeno
atmosferico, ma vengono uccisi dall'esposizione all'ossigeno, tutte le operazioni dal
prelievo, trasporto e conservazione del campione, alla semina e incubazione dello stesso,
devono essere condotte escludendo la presenza di ossigeno.
