Replicazione del DNA

Principi di genetica - Robert J. Brooker
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SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 11
Domande concettuali
C1. E' una struttura a doppio filamento che segue la regola dell'appaiamento AT/GC.
C2. Per replicazione bidirezionale si intende la replicazione del DNA in entrambe le direzioni a
partire da un’origine.
C3. L'affermazione C non è vera. Un nuovo filamento viene sempre sintetizzato a partire da un
filamento stampo preesistente. Perciò, una doppia elica contiene sempre un filamento più
vecchio dell'altro.
C4.
C5. No. In un meccanismo conservativo, una doppia elica sarebbe sempre completamente metilata
per cui le cellule non potrebbero ritardare il successivo ciclo di replicazione del DNA mediante
il meccanismo di metilazione.
C6. Assumiamo che ci siano 4 600 000 bp di DNA e che la replicazione avvenga in maniera
bidirezionale alla velocità di 750 nucleotidi al secondo. Se ci fosse una singola forca replicativa,
4600 000/750 = 6133 secondi, o 102,2 minuti.
Siccome la replicazione è bidirezionale, 102,2/2=51,1 minuti.
In effetti, questo è un valore medio che si basa su una varietà di condizioni di crescita. In condizioni
ottimali la replicazione può avvenire molto più velocemente.
Rispetto agli errori, se assumiamo un tasso di 1 errore ogni 100 000 000 nucleotidi, allora
4600 000 x 1000 batteri = 4600 000 000 nucleotidi di DNA replicato cioè
4600 000 000/100 000 000 = 46 errori.
Se ci pensi, questo è piuttosto sorprendente. In questa popolazione la DNA polimerasi
provocherebbe soltanto 46 errori su un totale di 1000 batteri, ciascuno dei quali contiene 4,6 milioni
di coppie di basi.
C7.
DNA Polimerasi
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C8. La DNA polimerasi scorrerebbe da destra a sinistra. Il filamento neosintetizzato sarebbe
3'–CTAGGGCTAGGCGTATGTAAATGGTCTAGTGGTGG–5'
C9. 1. DnaA box – Siti di legame per la proteina DnaA.
2. Siti di metilazione – Siti di metilazione dell'adenina che sono importanti per la regolazione
della replicazione del DNA.
3. Regioni ricche in AT – Siti in cui il DNA inizia la separazione dei filamenti per formare
un'apertura, talvolta denominata bolla replicativa.
C10.
A. Guardando la Figura 11.3, la prima, la seconda e la quarta DnaA box sono orientate nella stessa
direzione, mentre la terza e la quinta vanno nella direzione opposta. Una volta che hai realizzato
ciò, puoi riscontrare che le sequenze sono molto simili tra loro.
B. In accordo con la direzione della prima DnaA box, la sequenza consenso è
TGTGGATAA
ACACCTATT
C. Questa sequenza è lunga nove nucleotidi. Siccome ci sono quattro tipi di nucleotidi (cioè A, T, G,
e C), la possibilità che questa sequenza sia presente per caso è 49 che equivale a 262 144 nucleotidi.
Poiché il cromosoma di E. coli è lungo più di 10 volte questo valore, è molto probabile che questa
sequenza consenso sia osservata in altre posizioni. Il motivo per cui nonostante ciò non si osservano
origini multiple, sta nel fatto che l’origine possiede cinque copie della sequenza consenso molto
vicine tra loro. La probabilità di osservare cinque copie della sequenza consenso vicine tra loro per
il solo effetto del caso sarebbe molto piccola.
C11.
Α. La tua mano dovrebbe scivolare lungo il laccio bianco. L'estremità libera del laccio bianco
è l'estremità 5', e la DNA elicasi procede in direzione 5'→3'.
Β. La tua mano destra dovrebbe avvolgere il laccio bianco in un’ansa. Il laccio nero è il
filamento stampo per la sintesi del filamento guida. Per la sintesi di questo filamento la
DNA polimerasi III si sposta verso la forca replicativa. Il laccio bianco è lo stampo per il
filamento in ritardo, e deve essere avvolto ad ansa attorno alla DNA polimerasi III perché
l’enzima possa spostarsi verso la forca replicativa.
C12.
1. In base alla regola AT/GC, una pirimidina si lega sempre con una purina. Una transizione
coinvolge ancora una coppia pirimidina/purina, mentre una transversione causa un appaiamento tra
due purine o due pirimidine. La struttura della doppia elica rende più improbabile che si formi
questo tipo di appaiamento.
2. Il fenomeno dell’adattamento indotto della DNA polimerasi rende improbabile che l’enzima
catalizzi la formazione di legami idrogeno quando al filamento stampo si appaia un nucleotide
errato. Una transizione crea un’interazione negativa tra le basi dei filamenti opposti, ma ancor più
negativo è l’effetto di una transversione, che riguarda un appaiamento tra due purine oppure due
pirimidine.
3. La funzione di correzione di bozze della DNA polimerasi può identificare e rimuovere un
nucleotide errato che sia stato incorporato nel filamento nascente. Una transversione causerà una
distorsione molto grande nella struttura della doppia elica, e sarà più probabile che essa sia
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riconosciuta dalla DNA polimerasi.
C13. È necessario un primer per la sintesi di ogni frammento di Okazaki. La lunghezza media di
un frammento di Okazaki è compresa tra 1000 e 2000 bp. Se usiamo un valore medio di 1500
bp per ogni frammento di Okazaki, allora ci dovrebbero essere circa
4 600 000 / 1500 = 3067 copie.
C14. La primasi e la DNA polimerasi possono allontanare dallo stampo le proteine che legano il
DNA a singolo filamento.
C15.
A. L’eliminazione dei primer di RNA si svolge in direzione 5’ →3’, mentre la funzione di
correzione delle bozze avviene in direzione 3’ → 5’.
B. No. La rimozione dei primer di RNA avviene a partire dall'estremità 5' del filamento.
C16.
A. Il frammento di Okazaki a destra è il primo ad essere stato sintetizzato. Esso è il più lontano
dalla forca replicativa. La forca, che non si vede in questo disegno, sarebbe alla sinistra dei tre
frammenti di Okazaki e si muoverebbe da destra verso sinistra.
B. Il primer di RNA nel frammento di Okazaki a destra sarà rimosso per primo. La DNA polimerasi
inizierà l’allungamento del frammento centrale e rimuoverà il primer di destra grazie alla sua
attività esonucleasica 5’→3’. La DNA polimerasi I userà l’estremità 3’ del frammento di Okazaki
centrale come primer per sintetizzare il DNA nella regione dove è stato rimosso il primer di RNA.
Se il frammento centrale non fosse presente, la DNA polimerasi non potrebbe riempire questa
interruzione (perché necessita di un primer).
C. Hai bisogno della DNA ligasi solo in corrispondenza della freccia di destra. La DNA polimerasi I
inizia dall’estremità del frammento a sinistra e sintetizza il DNA per riempire la regione, fintanto
che rimuove il primer di RNA centrale. In corrispondenza della freccia di sinistra, la DNA
polimerasi I sta semplicemente allungando il frammento di Okazaki di sinistra. Qui la ligasi non
serve. Quando la DNA polimerasi I ha allungato il filamento di sinistra fino alla regione dove è
stato rimosso il primer di RNA, e va a raggiungere il DNA del frammento di Okazaki centrale. Qui
siamo alla freccia di destra, e in questo punto c’è un’estremità 5’ con un monofosfato. La DNA
ligasi serve a collegare questo nucleoside monofosfato con l’estremità 3’ della regione dove è stato
rimosso il primer di RNA centrale.
D. Come menzionato nella parte C, l’estremità al 5’ del DNA del frammento di Okazaki centrale è
un nucleoside monofosfato, che precedentemente era collegato al primer di RNA tramite un legame
fosfoesterico. Perché la DNA polimerasi possa funzionare, l’energia che serve a collegare due
nucleotidi deriva dall’idrolisi del nucleoside trifosfato libero. Però in questa posizione il nucleotide
è già presente al 5’ del DNA ed è un nucleoside monofosfato. La DNA ligasi collega questo
nucleotide con il frammento di Okazaki di sinistra usando energia, che viene ottenuta dall’idrolisi di
ATP o NAD+.
C17. La metilazione del DNA è l'aggiunta covalente di gruppi metilici alle basi del DNA.
Immediatamente dopo la replicazione del DNA, i filamenti neosintetizzati non sono metilati.
L'inizio della replicazione del DNA a livello del sito di origine non avviene prima che la
sequenza non sia completamente metilata. Perciò, il ritardo nella metilazione del DNA serve a
impedire la replicazione prematura del DNA immediatamente dopo la divisione cellulare.
C18.
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1 . Riconosce l’origine di replicazione.
2. Inizia la formazione della bolla di replicazione.
3. Recluta l’elica in questa regione.
C19. Sarebbe difficile ritardare la replicazione del DNA dopo la divisione cellulare, perché la
diluizione della proteina DnaA è un meccanismo che regola la replicazione. Ci si potrebbe
aspettare che un tale ceppo abbia più copie per cellula del cromosoma batterico rispetto a un
ceppo normale.
C20. Il disegno dovrebbe raffigurare una proteina che viaggia lungo il filamento di DNA e separa le
due eliche.
C21. Un frammento di Okazaki è un breve segmento di DNA di nuova sintesi nel filamento in
ritardo. La produzione di questi brevi frammenti è necessaria perché nel filamento in ritardo la
forca replicativa espone i nucleotidi in direzione 5’ → 3’, ma la DNA polimerasi si sposta
lungo il filamento stampo in direzione 3’ → 5’ allontanandosi dalla forca replicativa. Perciò, il
filamento lagging neosintetizzato viene prodotto mediante brevi frammenti che vengono poi
legati tra loro.
C22. Il filamento guida ha un solo primer all’origine, dopodiché la DNA polimerasi III lo sintetizza
in modo continuo nella direzione della forca replicativa. Nel filamento in ritardo vengono formati
molti piccoli segmenti di DNA, i frammenti di Okazaki. Ciò richiede molti primer di RNA, che
sono poi rimossi dalla DNA polimerasi I. Questo enzima inoltre riempie le interruzioni rimaste con
DNA. Infine la DNA ligasi collega covalentemente i frammenti di Okazaki. Un complesso di questi
enzimi, quale il primosoma o il replisoma fornisce il coordinamento tra le diverse fasi del processo
replicativo e quindi permette di procedere più rapidamente ed efficientemente.
C23. Il sito attivo della DNA polimerasi ha la capacità di riconoscere un nucleotide appaiato in
modo non corretto in un filamento di nuova sintesi, e di rimuoverlo mediante un taglio
esonucleasico. La correzione delle bozze avviene in direzione 3’ → 5’. Dopo che l'errore di
appaiamento è stato rimosso, la DNA polimerasi riprende la sintesi di DNA in direzione 5’
→ 3’.
C24. Un enzima processivo resta agganciato al proprio substrato. Nel caso della DNA polimerasi,
esso resta agganciato al filamento stampo e sintetizza il nuovo filamento. Questo permette che la
sintesi di DNA proceda più rapidamente.
C25. È necessario che la replicazione del DNA sia regolata per mantenere il numero corretto di
cromosomi in ogni cellula. Se la replicazione fosse troppo lenta, le cellule figlie potrebbero
non ricevere alcun cromosoma. Se fosse troppo veloce, esse potrebbero riceverne troppi.
C26. La ragione è la sua incapacità di sintetizzare il DNA nella direzione 3’→ 5’ e il bisogno del
primer. La telomerasi differisce dalla DNA polimerasi perché per la sintesi utilizza come stampo
una propria sequenza di RNA. Siccome usa questa sequenza molte volte di seguito, essa produce
una sequenza ripetuta in tandem all’estremità telomerica 3’ dei cromosomi lineari.
C27. Il filamento opposto viene sintetizzato in modo convenzionale dalla DNA polimerasi usando
come stampo il filamento prodotto dalla telomerasi.
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C28. Cinquanta, perché da ciascuna origine si dipartono due forche di replicazione: la replicazione
del DNA è bidirezionale.
C29. Le estremità indicate con B e C non possono essere replicate dalla DNA polimerasi. La
DNA polimerasi produce un filamento in direzione 5’ → 3’ usando un filamento stampo
disposto in direzione 3’ → 5’. Inoltre, la DNA polimerasi necessita di un primer. Alle estremità
B e C, non vi è posto (a monte) per la sintesi di un primer.
C30.
A. Sia la trascrittasi inversa che la telomerasi usano uno stampo di RNA per produrre un filamento
complementare di DNA.
B. Siccome la trascrittasi inversa non possiede un’attività di correzione di bozze, è più facile che
introduca degli errori. Questo crea molti ceppi mutanti di virus. Alcune mutazioni possono impedire
al virus di riprodursi. Tuttavia altre mutazioni possono impedire al sistema immunitario di
combattere il virus, e queste aumenteranno le capacità proliferative virali.
C31. Come illustrato nella Figura 11.18, il primo passaggio coinvolge il legame della telomerasi
al telomero. L'estremità 3' sporgente si lega all'RNA complementare nella telomerasi. Per
questo motivo, per la telomerasi è necessario possedere una porzione 3' sporgente per replicare
il telomero.
Domande sperimentali
S1.
A. Quattro generazioni: 7/8 leggere, 1/8 di peso intermedio; cinque generazioni: 15/16 leggere,
1/16 di peso intermedio.
B. Tutte le doppie eliche di DNA sarebbero pesanti per 1/8.
14
C. Il gradiente di CsCl separa le molecole in base alla loro densità. I composti contenenti N
15
presentano una densità inferiore rispetto a quelli contenenti N. Le basi del DNA
contengono azoto. Se le basi contengono solamente 15N, il DNA sarà pesante e sedimenterà
a una densità maggiore. Se le basi contengono solamente 14N, il DNA sarà leggero e
sedimenterà a una densità inferiore. Se le basi di un filamento contengono 14N e quelle del
filamento opposto 15N, il DNA sarà di peso intermedio e sedimenterà a una densità
intermedia.
S2.
A. Avresti visto probabilmente ancora una banda, ma soltanto una banda pesante.
B. Probabilmente non avresti visto una banda, perché il DNA non sarebbe stato rilasciato dai
batteri, che avrebbero sedimentato sul fondo della provetta.
C. Non avresti visto una banda. La luce UV è necessaria per visualizzare il DNA, che assorbe la
luce nella regione UV.
S3. Potresti determinare il numero delle forche replicative e le loro localizzazioni approssimative.
Per i cromosomi con una sola origine di replicazione, potresti determinare che la replicazione è
bidirezionale. Tuttavia, non otterresti alcuna informazione di natura molecolare circa il
processo della replicazione del DNA.
S4. Iniziando con un filamento di DNA a singolo filamento, avresti bisogno di un primer (o della
primasi), dNTP, e DNA polimerasi. Iniziando con un DNA a doppia elica, avresti bisogno anche di
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un’elicasi. L’aggiunta delle proteine che legano il DNA a singolo filamento e la topoisomerasi può
essere di aiuto.
S5. Dovresti aggiungere uno stampo di DNA con un'estremità 3' sporgente complementare alla
sequenza del telomero. Dovresti anche aggiungere la telomerasi e i dNTP.
S6. Questo è un punto critico perché hai bisogno di separare la radioattività presente nei nucleotidi
non legati da quella del filamento neosintetizzato. Se usi un acido che precipita i nucleotidi e il
filamento di DNA, tutta la radioattività sarà nel pellet. Otterresti così la stessa quantità di segnale
radioattivo indipendentemente da quanto DNA neosintetizzato sia presente. L’acido perclorico è
cruciale perché separa la radioattività dei nucleotidi liberi da quella del filamento neosintetizzato.
S7. No, perché l'idrolisi dei deossiribonucleosidi trifosfato fornisce l'energia necessaria per la
sintesi dei nuovi filamenti.
S8.
A. L’estremità sinistra è l’estremità 5’. Se tu ruoti la sequenza del primo primer su se stessa, noterai
che essa è complementare all’estremità destra dello stampo di DNA. L’estremità 5’ del primo
primer si lega all’estremità 3’ dello stampo.
B. La sequenza sarebbe 3'–CGGGGCCATG–5'. Essa non potrebbe essere usata perché l’estremità
3’ del primer è alla fine dello stampo di DNA. Non ci sarebbe spazio per aggiungere nucleotidi
all’estremità 3’ del primer e legarsi al filamento stampo.
S9. Affinché un filamento di DNA si allunghi, viene formato un legame fosfoesterico tra il gruppo
3'-OH di un nucleotide e il gruppo 5' fosfato più interno nel nucleotide che deve essere
aggiunto (confronta la Figura 11.7). Se manca il gruppo -OH, non può formarsi il legame
fosfoesterico.
S10.
A. Le due eliche sono separate col calore perciò non hai bisogno dell’elicasi.
B. Ogni primer dovrebbe essere una sequenza complementare a uno dei filamenti di DNA. Ci sono
due tipi di primer, e ciascuno si lega a uno dei due filamenti complementari.
C. Viene usata una DNA polimerasi termofila perché la DNA polimerasi isolata da specie non
termofile verrebbe inattivata permanentemente durante la fase di riscaldamento della PCR. Ricorda
che la DNA polimerasi è una proteina, e la gran parte delle proteine viene denaturata al calore.
Tuttavia le proteine degli organismi termofili si sono evolute per resistere al calore, che è la ragione
per cui questi organismi sopravvivono ad alte temperature.
D. A ciascun ciclo, la quantità di DNA viene raddoppiata. Poiché all’inizio ci sono 10 copie di
DNA, dopo 27 cicli ci saranno 10 x 227 copie ossia 1,34 x 109 copie di DNA. Come puoi vedere la
PCR amplifica la quantità di DNA in modo davvero stupefacente!