PROFILI DI ESPRESSIONE DI GENI SENSIBILI ALLE ALTERAZIONI

Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 109-111
S. Franzellitti, F. Donnini, E. Fabbri
Centro interdipartimentale di ricerca per le scienze ambientali (CIRSA), Università di Bologna,
Via S. Alberto, 163 - 48100 Ravenna, Italia.
[email protected]
PROFILI DI ESPRESSIONE DI GENI SENSIBILI
ALLE ALTERAZIONI AMBIENTALI
COME INDICATORI DELL’ESPOSIZIONE
A FATTORI DI STRESS IN AMBIENTI MARINI COSTIERI
GENE EXPRESSION PROFILES AS INDICATORS OF STRESS
EXPOSURE IN COASTAL MARINE ENVIRONMENTS
Abstract – Mussels were transplanted for 30 days in a contaminated channel within the coastal lagoon
Pialassa Baiona (RA). Samples were collected after 2, 5, 7, 14 and 28 days and analysed for the classical biomarkers and for the expression of metallothionein (MT10 and MT20) and heat shock proteins
(HSP70 and HSC70) genes. Gene expression increased with time consistently with the stress syndrome
development.
Key-words: Mytilus galloprovincialis, metallothionein, Hsp70, mercury, gene expression.
Introduzione – Gli ambienti marini costieri sono soggetti all’impatto di numerose
attività antropiche, quali un’intensa urbanizzazione, l’agricoltura, e le attività industriali. Gli organismi che vivono in tali ambienti sono pertanto esposti a molteplici
fattori di stress, che inducono evidenti alterazioni di specifici parametri biochimico/
fisiologici o genetici. Molti di questi sono misurabili in modo relativamente semplice
e ripetibile, e definiti biomarker. Al fine di valutare la relazione tra biomarker consolidati e l’espressione genica, abbiamo analizzato le risposte di alcuni biomarker e
i profili di espressione di geni sensibili alle alterazioni ambientali nel mitilo Mytilus
galloprovincialis, largamente utilizzato come sentinella ambientale nei programmi di
biomonitoraggio di ambienti marini costieri (Viarengo et al., 2007)
Materiali e metodi – In esperimenti in condizioni controllate abbiamo esposto i
mitili a noti fattori di stress in acquario (stress termico: 35 °C, 1 ora; metalli pesanti:
Hg2+ o CH3Hg+ 0.75 µM, da 8 ore a 6 giorni). A ogni gruppo di esperimenti è stato
associato un gruppo di organismi di controllo, mantenuto nelle stesse condizioni di alimentazione, temperatura (eccetto per gli esperimenti di stress termico, in cui il gruppo
di organismi di controllo è stato mantenuto a 16 °C nel corso dell’esperimento), e
ossigenazione degli organismi sottoposti al trattamento.
Gruppi di 60 mitili sono stati trapiantati per diversi periodi (da 2 fino a 30 giorni)
nel Canale Magni della Pialassa Baiona, una zona lagunare situata a nord-est di
Ravenna, noto per gli alti livelli di inquinamento ambientale, in particolare da mercurio. In questo caso, il controllo sperimentale è rappresentato da un gruppo di 60 mitili
sacrificati e dissezionati nello stesso giorno in cui è avvenuto il posizionamento in Pialassa (tempo zero). Sia per i mitili campionati al tempo zero che per quelli trapiantati
in Pialassa, i tessuti sono stati opportunamente prelevati, congelati immediatamente in
azoto liquidi e conservati a -80 °C fino al momento del loro utilizzo.
Sono state valutate le risposte di due biomarkers, la stabilità delle membrane lisosomiali e i livelli di metallotioneine (MT). Inoltre, dopo estrazione dell’RNA totale dai
tessuti di mitilo, è stata valutata l’espressione dei geni per le proteine HSP70. Per il
sequenziamento dei tratti genici ed i primers utilizzati si fa riferimento a Franzellitti e
Fabbri (2005) per MgHSP70 e MgHSC70; Dondero et al. (2005) per MT10 e MT20,
e Franzellitti e Fabbri (2006) per il trasportatore Pgp.
S. Franzellitti, F. Donnini, E. Fabbri
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Risultati – Gli esperimenti condotti in laboratorio hanno dimostrato che l’espressione
dei prodotti genici HSP70 è diversamente regolata dall’esposizione allo stress termico
e ai metalli pesanti analizzati (Tab. 1). L’andamento temporale della risposta ad Hg2+
e a CH3Hg+ indica che mentre MgHSP70 è indotto in modo transiente come risposta
immediata, MgHSC70 rappresenta la risposta citoprotettiva a lungo termine. I prodotti
genici MT10 e MT20 di mitilo, codificanti per due isoforme proteiche di MT, sono
entrambi sovra-espressi nei mitili esposti ad Hg2+. Il prodotto genico codificante per il
trasportatore Pgp è anch’esso differentemente regolato da Hg2+ e CH3Hg+, indicando
una funzione della forma chimica del metallo nell’indurre la risposta citoprotettiva.
Tab. 1 - Variazione dei profili di espressione genica in mitili esposti a stimoli stressori in condizioni
di laboratorio. I dati rappresentano la media ± errore standard della percentuale di variazione dei livelli di espressione nei campioni trattati rispetto ai mitili di controllo. *p<0.05
vs controllo, 1-way ANOVA seguito da Mann-Whitney post hoc test.
Gene expression profiles of mussels exposed to model stress stimuli under laboratory conditions. Data
represent the mean ± SEM of the percentage of variation in treated samples with respect to control
values. *p<0.05 vs control, 1-way ANOVA followed by the Mann-Whitney post hoc test.
temperatura
(35°C, 1 ora)
Espressione gene MgHSP70
250 ± 20*
Espressione gene MgHSC70
108 ± 8
Espressione gene MT10
Espressione gene MT20
Espressione gene MgPgp
[Hg2+] = 0.75 µM
8 ore 3 giorni
150
200
± 0.8*
± 2*
95
102
± 1*
±3
2000
± 20*
2500 ±
30*
180
16.4
± 5*
± 0.7*
[CH3Hg+] = 0.75 µM
6 giorni
102.4
± 0.6
280
± 5*
1800 ±
16*
4000 ±
20*
15.6
± 0.9*
8 ore
40
± 3*
220
± 4*
6 giorni
20.0
± 3.5*
235
± 7*
550
± 10*
530
± 15*
Tab. 2 - Variazione dello stato di salute e dei profili di espressione genica in mitili trapiantati per
diversi periodi in Canale Magni (Pialassa Baiona, Ravenna, Italia). I dati rappresentano la
media ± errore standard della percentuale di variazione ai vari tempi di campionamento
rispetto ai livelli rilevati nei mitili al tempo zero (controllo). *p<0.05 vs controllo, 1-way
ANOVA seguito da Mann-Whitney post hoc test.
Gene expression profiles and health status of mussels transplanted for different exposure periods within
the Magni Channel (Pialassa Baiona, Ravenna, Italy). Data represent the mean ± SEM of the percentage of variation in transplanted mussels at the different time points with respect to control values.
*p<0.05 vs control, 1-way ANOVA followed by the Mann-Whitney post hoc test.
Stabilità delle membrane lisosomiali
Espressione metallotioneine
Espressione gene MT10
Espressione gene MT20
Espressione gene MgHSP70
Espressione gene MgHSC70
Espressione gene MgPgp
Tempo zero
(controllo)
100
100
100
100
100
100
100
2 giorni
7 giorni
30 giorni
99.0 ± 1.5
101 ± 5
260 ± 10*
60 ± 15*
600 ± 30*
506 ± 7*
380 ±15*
95 ± 2
150 ± 5*
418 ± 13*
100 ± 8
445 ± 10*
495 ± 12*
439 ± 8*
60 ± 2*
217 ± 8*
200 ± 15*
40 ± 12*
320 ± 12*
450 ± 20*
400 ± 18*
Profili di espressione di geni sensibili alle alterazioni ambientali
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I biomarker valutati nei mitili posizionati nel Canale Magni sono alterati rispetto a
quelli di organismi di controllo (tempo zero), e indicano il progressivo sviluppo di una
grave sindrome da stress (Tab. 2). I livelli di espressione genica e proteica delle MT
sono univoci nel confermare la contaminazione da metalli pesanti nel sito in esame.
Infatti, mentre il gene MT10 è significativamente sovra-espresso già dopo 2 giorni,
l’aumento della relativa espressione proteica è significativo solo dopo una settimana e
continua ad aumentare, indicando che l’analisi dell’espressione genica è un metodo di
rilevazione più precoce. La rapida sovra-espressione del gene inducibile MgHSP70 è
un fenomeno atteso nei mitili esposti a diversi fattori di stress ambientale. Nei mitili in
Canale Magni la sua sovra-espressione è mantenuta per tutta la durata dell’esperimento
indicando una perdurante situazione di stress (Tab. 2). Sebbene lo stress prototipo per
la induzione delle HSP inducibili sia quello termico, che è presente nell’ambiente in
esame come già segnalato in passato (Donnini, 2004), la risposta è indotta anche da
altri fattori, quali i metalli pesanti. Gli esperimenti di laboratorio dimostrano che il
gene MgHSC70 non è influenzato dallo shock termico, mentre è attivato dalla prolungata esposizione a metalli pesanti. La significativa sovra-espressione di MgHSC70 nei
mitili trapiantati nel Canale Magni indica quindi una esposizione a stress prolungati e
intensi, quali lo stress termico e composti xenobiotici di varia natura. Questo dato è
confermato anche dalla sovra-espressione di Pgp, un trasportatore di membrana attivato in presenza di xenobiotici.
Conclusioni – Sia i fattori di stress analizzati in laboratorio che l’esposizione dei
mitili ad un ambiente contaminato hanno indotto evidenti alterazioni dei profili di
espressione genica riconducibili a una sindrome da stress contratta dai mitili. I prodotti genici analizzati sono indici estremamente precoci dei fenomeni di tossicità in
atto, in accordo con i dati reperibili in bibliografia sull’utilizzo di marcatori molecolari
per lo studio della risposta allo stress ambientale (Viarengo et al., 2007).
Bibliografia
DONDERO F., PIACENTINI L., BANNI M., REBELO M., BURLANDO B., VIARENGO A.
(2005) – Quantitative PCR analysis of two molluscan metallothionein genes unveils differential
expression and regulation. Gene, 345: 259-270.
DONNINI F. (2004) - Utilizzo di Biomarker e indagini geochimiche integrate per la valutazione
della qualità ambientale di una laguna costiera, la Piallassa Baiona. Tesi di Laurea Università di
Bologna.
FRANZELLITTI S., FABBRI E. (2005) - Differential HSP70 gene expression in the Mediterranean
mussel exposed to various stressors. Biochem. Biophys. Res. Comm., 336: 1157-1163.
FRANZELLITTI S., FABBRI E. (2006) - Cytoprotective responses in the mediterranean mussel
exposed to Hg2+ and CH3Hg+. Biochem. Biophys. Res. Comm., 351: 719-725.
VIARENGO A., LOWE D., BOLOGNESI C., FABBRI E., KOEHLER A. (2007) - The use of
biomarkers in biomonitoring: a 2-tier approach assessing the level of pollutant-induced stress syndrome in sentinel organisms. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol., 146: 281-300.