Elettroforesi esercitazione File - Progetto e

L’elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata
in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche.
Dott.ssa Angelucci C.B.
L’elettroforesi è una tecnica che viene usata per separare molecole
elettricamente cariche.
1. relativamente poco costosa
2. rapida
3. versatile
Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le
proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionizzabili e
possono esistere in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come
cationi, sia come anioni.
Anche composti tipicamente non ionici, come i carboidrati, possono
assumere una carica se trasformati chimicamente oppure se sono strutturati
in polimeri complessi quali i glicosamminoglicani.
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L’elettroforesi viene condotta su un supporto inerte ed omogeneo (gel o
matrice), il campione viene sciolto in un opportuno tampone con il quale
viene saturato l’eventuale supporto in modo da consentire la conduzione della
corrente.
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La matrice può essere composta da una varietà di differenti materiali,
inclusa la carta, l’acetato di cellulosa, o gel fatti di poliacrilammide e
agarosio.
Poliacrilammide: L'acrilammide è l'ammide dell'acido acrilico. A
temperatura ambiente si presenta come un solido cristallino incolore
o leggermente bianco, solubile in acqua con reazione fortemente
endotermica. La poliacrilammide è un derivato polimerico, che sotto
forma di gel trova applicazione come mezzo di risoluzione e
separazione delle proteine nell'elettroforesi e nella cromatografia.
Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008)
tossico
estremamente
tossico
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Agar: L’agar è una miscela, non tossica ricavato da alghe rosse, di due
polimeri derivati dal galattosio: l’agarosio e l’agaropectina.
Sottoforma di gel all’1% l’agar presenta un elevato contenuto d’acqua,
una buona struttura fibrosa, un diametro dei pori elevato ed una bassa
resistenza frizionale.
I gel di agarosio sono usati
soprattutto per la separazione
di acidi nucleici e frammenti di
DNA; in questo caso la
migrazione differenziale è
funzione semplicemente del
numero di basi di cui sono
composti gli acidi nucleici da
separare.
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Da considerazioni di carattere fisico, si risale alla seguente formula:
Ve =
qxE
6π x η x r
La velocità elettroforetica (Ve) è direttamente proporzionale alla
carica della particella (q) e al campo elettrico applicato (E=V/d) e
inversamente proporzionale alla viscosità (η) e alle dimensioni
della particella (r), quindi nel caso di particelle aventi la stessa
carica, migrerà più velocemente la particella di raggio minore.
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Elettroforesi su gel di poliacrilammide
Due Tipi:
• Elettroforesi Nativa: le proteine si muovono in funzione della loro
massa e della loro carica netta
• Elettroforesi Denaturante in presenza di SDS (SDS-PAGE): le
proteine, uniformemente dotate di carica negativa (SDS), si muovono in
base alla loro massa.
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SDS-PAGE
(Sodium-Dodecyl-Sulphate-Polyacrilamide-Gel-Electrophoresis)
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SDS-PAGE
E’ uno dei metodi più largamente usati per separare le proteine e
determinare il loro peso molecolare apparente.
Abbinata al Western Blot e all’Immunocolorazione costituisce
un metodo riproducibile, rapido ed efficace per l’isolamento e
l’identificazione delle proteine.
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(SDS-PAGE)
In condizioni denaturanti le proteine sono separate in un gel di
poliacrilammide in base alla loro massa molecolare (MM)
La miscela proteica è trattata con :
H3C-(CH2)10-CH2OSO3-Na+
Sodio dodecil solfato (SDS)
detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti
delle proteine native
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Gli anioni dell’ SDS si legano alle catene principali in un rapporto di:
~ 1 molecola di SDS e 2 residui di amminoacidi
I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa
Sottoposte ad un campo elettrico le proteine migrano dal catodo- all’anodo+ in
base alla loro massa molecolare
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Fasi di una SDS-PAGE
1 - Montaggio dell’apparato;
2 - Preparazione del gel;
3 - Preparazione e caricamento dei campioni;
4 - Corsa elettroforetica;
5 - Colorazione;
6 - Studio dell’immagine ottenuta.
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1-Montaggio dell’apparato:
- Lastra di vetro grande;
- Lastra di vetro piccola;
- Spaziatori;
- Castello;
- Pettini;
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Porosità del gel
% T 5-12 10-15 ≥ 15 Intervallo di frazionamento 20.000 – 150.000 10.000 – 80.000 ≤ 15.000 Generalmente al crescere di % T la dimensione dei pori decresce perché l’acrilammide
è più concentrata, mentre al disotto del 3% si perde l’effetto setacciante.
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La dimensione dei pori è funzione della quantità totale di monomeri
(% T) presenti nella soluzione e del rapporto tra l’agente cross-lincante
e l’acrilammide (% C).
Più spesso la composizione del gel viene data come rapporto in peso
acril:bis-acril (per es. 30:0,8).
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I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell’uso facendo
copolimerizzare acrilamide con metilen-bisacrilammide, un agente cross-lincante, in
presenza di una catalizzatore come il persolfato di ammonio (APS) allo 0,1-0,3% e un
iniziatore come il TEMED. Questa polimerizzazione radicalica viene fatta avvenire
all’interno dello spazio compreso tra due vetri, in modo da ottenere una matrice piatta
con spessore che varia da 0,75 mm a 1,5 mm.
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N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine
Il TEMED catalizza la rottura omolitica dell’APS, producendo così
i radicali necessari per la reazione di polimerizzazione radicalica
dell’acrilammide.
Il TEMED va conservato al buio, a RT, e possibilmente, in
ambiente anidro. Questo perché il TEMED è igroscopico ed in
presenza di acqua si ossida perdendo le sue proprietà catalitiche. Il
TEMED ossidato si riconosce in quanto assume colorazione
giallastra.
Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008)
Simboli di rischio chimico
infiammabile
corrosivo
Nocivo
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Ammonio persolfato
L’APS è una molecola instabile, ed estremamente igroscopica.
Quando è sciolto in acqua si scompone spontaneamente, pertanto si
consiglia di preparare la soluzione appena prima dell’uso.
Generalmente, si prepara una soluzione madre al 10 % e la si
conserva a -20 °C.
APS e TEMED aggiunti in quantità eccessive, oltre ad alterare le
proprietà del gel, possono ossidare le proteine del campione.
Pittogramma di pericolo (regolamento CE 1272/2008)
Simboli di rischio chimico
estremamente Comburente
tossico
Nocivo
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2-Preparazione del gel
- Preparazione del resolving gel o gel di risoluzione. La scelta della % di
acrilamide è in base alle dimensioni della proteina in esame);
- Preparazione dello stacking gel o gel di impaccamento (4-5%)
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Resolving gel al 12%
Componenti:
Volume 20 ml
H2O
6.6
30% acrilamide
8.0
1.5 M Tris/HCl (pH 8.8)
5.0
10% SDS
0.2
10% ammonio persolfato
0.2
TEMED
0.008
Proteine Maglie di acrilamide Dott.ssa Angelucci C.B.
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Menisco di ossigeno
butanolo saturo di acqua
(10:1)
gel di separazione
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Preparazione dello Stacking al 5 %:
Componenti:
Volume 10 ml
H2O
6.8
30% acrilamide
1.7
1.0 M Tris/HCl (pH 6.8)
1.25
10% SDS
0.1
10% ammonio persolfato
0.1
TEMED
0.01
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Gel di impaccamento
Dopo circa 1 h dalla deposizione del gel di separazione, si stratifica
su di esso il gel di impaccamento (o stacking)
Pettine
Il gel di impaccamento ha un pH di 6,8 e
un rapporto di acrilam/bis-acrilam pari al
4-5%
stacking gel
Appena deposto il gel di impaccamento.
separating gel
si dispone il pettine per la formazione dei
pozzetti
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Quando i gel si sono solidificati si
rimuove il pettine, lasciando nello
stacking la serie di pozzetti pronti per
il caricamento dei campioni.
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3-Preparazione dei campioni
- Campione contenente l’Albumina:
- Sample buffer 5x
(Tris/HCl 0.3 M pH 6.8, 10% SDS, 0.05% Blu di Bromofenolo,
50% Glicerolo e 500 mM DTT)
- Riscaldare a 95° C per 5 minuti
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Preparazione dei campioni
SDS: Denatura le proteine e conferisce la stessa densità di carica
negativa
DTT (ditiotreitolo) e b-Mercaptoetanolo: Rompe eventuali ponti
disolfuro
Glicerolo: Aumenta la densità dei campioni depositandoli nel
pozzetto
Blu di bromofenolo: Visualizza i campioni e va a costituire il fronte
di migrazione
Bollitura
(100°C per 2-3 minuti): Accelera la completa
denaturazione
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3-Caricamento dei campioni
Inserimento dei campioni tra le due lastre di vetro
mediante puntali monouso
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Il gel di poliacrilamide ha una capacità limitata e sovraccaricarlo con le proteine
può dare risultati di precipitazioni ed aggregazione, produzione di striature e
macchie. I risultati migliori si ottengono caricando, per ogni pozzetto, 10 µl di
proteina denaturata concentrata 2 mg /ml.
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4-Corsa elettroforetica
- connessione all’alimentatore di corrente;
- impostazione dei valori di voltaggio o amperaggio desiderato;
- avvio della corsa;
- arresto della corsa quando si vede che il fronte e’ giunto
alla fine del gel.
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4-Corsa elettroforetica
Stacking gel
8.8
8.8
8.8
Resolving gel
8.8
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5-Colorazione
1. Colorazione di proteine con coloranti che si legano con forza
ad esse.
Rosso Ponceau
Blue di Coomassie
Colorazione con Argento
Analisi
Dopo preventivo essiccamento (gel dryer system) le proteine colorate
su gel possono essere analizzate (PM, quantità) tramite densitometria
(scanner, digital camera, densitometro)
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Rosso Ponceau
La colorazione tramite rosso di ponceau è utilizzata per rilevare e colorare le proteine su
acetato di cellulosa, PVDF e membrane di nitrocellulosa. La procedura è reversibile e non
invasiva e permette ulteriori test di carattere immunologico sul campione. Il limite minimo
per l’identificazione è di 250 ng di proteina in gel di poliacrilamide. Il colorante è
fortemente elettronegativo e si lega ai gruppi amminici della proteina, oltre che alle
regioni non covalenti e non polarizzate.
Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle,
evidenziare l'area di lavoro le linee di corsa. Queste informazioni sono utili per tagliare la
membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie linee o verticalmente o
orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.
10 ml H2O distillata
0.3 ml acido aceticog laciale
0.033 g Ponceau S
Fino a 30 ml con H2O distillata
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Blue di Coomassie Il blue Coomassie si lega alle proteine attraverso legami ionici tra i gruppi sulfonici del
colorante e i gruppi amminici delle proteine oltre che attraverso forze di VanderWaals
Colorante-SO3-+NH3-L-COOH
Procedura di colorazione:
1. rimozione del gel dall’apparato di corsa e inserimento in una vaschetta pulita
2. trattamento gel con acido acetico diluito e metanolo per fissaggio proteine al
gel e rimozione dell’SDS
3. immersione del gel nel colorante sciolto in acido acetico diluito e metanolo
da 5 min a 1 h
4. rimozione del colorante non legato alle proteine tramite immersione del gel
in acido acetico diluito e metanolo
NB Con questo metodo si possono quantificare le proteine sottoponendo il gel a
scansione con un densitometro
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Blue di Coomassie Dott.ssa Angelucci C.B.
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Colorazione con l’argento
Procedura:
1. rimozione del gel dall’apparato di corsa e inserimento in una
vaschetta
2. trattamento gel con acido acetico diluito e metanolo per fissaggio
proteine al gel e rimozione dell’SDS
3. Incubazione del gel con una soluzione acida di nitrato di Ag che
reagisce con le proteine
4. Incubazione con formaldeide a pH alcalino che riduce Ag+
ad Ag metallico che colora le proteine a cui si era precedentemente
legato
5. Arresto della reazione con acido acetico
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Colorazione con l’argento
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Essicamento del gel
Una volta “colorati” i gel devono essere essiccati per una buona e lunga conservazione
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6 - Studio dell’immagine ottenuta A
B
1
2
3
4
5
6
C
D
E
F
Standard (low range)
MM
A- Fosforilasi B
B- BSA
C- Ovalbumina
D- Anidrasi carbonica
E- Inibitore della tripsina
F- Lisozima
97.400
66.200
45.000
31.000
21.500
14.400
1, 2, 3, 4, 5, 6 = campioni di albumina
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Determinazione della massa molecolare
di catene polipeptidiche
Mobilità relativa di ciascuna proteina
5
Standard
4,8
Campione
4,6
Log PM
Log PM
4,4
4,2
y = 5,0635 - 0,19269x R= 0,99031
4
0
1
2
3
4
5
Mobilità relativa
Mobiltà relativa
Standard e Campione
Standard in nero, campione in blu
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Principali impieghi di una SDS-PAGE
Controllo di omogeneità (purificazione di una proteina)
Caratterizzazione (determinazione del peso molecolare)
Proteomica (analisi dell’insieme di proteine di una cellula)
Analisi con anticorpi (Western Blotting)
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5-Colorazione
- Coomassie Brilliant Blue R-250
- Nitrato di argento (10 a 100 volte piu’ sensibile della colorazione con
Coomassie Brilliant Blue R-250)
- Metodi immunochimici previo trasferimento su membrana.
Ab anti lectina
Ab anti lox-1
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