Farmaci dalle piante: il ruolo delle biotecnologie

P ingegneria genetica
Farmaci dalle piante:
il ruolo delle biotecnologie
Sin dall’antichità le piante
sono state una preziosa fonte
di sostanze medicamentose
prima e di principi attivi poi.
Più recentemente, grazie
all’impiego delle tecniche
d’ingegneria genetica, gli
organismi vegetali hanno
acquisito importanza anche
per la produzione di proteine
ricombinanti, con applicazioni
profilattiche, diagnostiche e
terapeutiche. Le tecnologie
alla base della produzione dei
“farmaci verdi” risultano, per
molti aspetti, vantaggiose ed
adattabili a diverse esigenze
di Eros Fabrizi e Caterina Lucchini
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Nell’immaginario comune l’utilizzo
proteine eterologhe, attraverso una pratica
Rispetto ad altri sistemi produttivi le piante
delle piante in campo medico richiama
denominata Molecular Farming.
offrono alcuni particolari vantaggi come il
immediatamente alla mente parallelismi
L’insieme delle proteine che attualmente
minor costo per gli impianti di produzione,
come “Aspirina e Salice piangente ”,
possono essere ottenute con queste
la capacità di assemblare e modificare
“Acido rosmarinico e Rosmarino” o,
tecnologie è già molto vasto ed include
molecole complesse, l’assenza di patogeni
per i più esperti, “Tassolo e Tasso del
antigeni per la produzione di vaccini a
e/o tossine potenzialmente pericolosi per
Pacifico”. Le piante possono però essere
subunità, anticorpi per uso diagnostico
la salute umana e la possibilità di adattare
utilizzate non solo per l’estrazione di
e terapeutico, anticoagulanti, ormoni,
più facilmente i livelli di produzione
agenti farmacologicamente attivi, ma
enzimi, microbicidi, albumina, interferoni
secondo le esigenze (Fischer and Emans
anche per l’espressione ad alti livelli di
e così via (Ma et al. 2003, Ma et al. 2005).
2000, Ma et al. 2003, Twyman et al.
2003). L’essere in grado di ingegnerizzare
organismi vegetali, oltre ad affascinare le
menti di numerosi scienziati, porta con se
anche risvolti assai più concreti.
È stato stimato, infatti, che il valore
di mercato dei prodotti ricombinanti
biofarmaceutici sintetizzati in pianta
raggiungerà negli Stati Uniti i 2,2 miliardi di
dollari nel 2011, una somma considerevole!
Il dottor Teodoro Cardi, Primo Ricercatore
presso l’Istituto di Genetica Vegetale del
CNR di Portici, porta avanti da numerosi
anni progetti di ricerca incentrati sulla
genetica vegetale. Cardi ci ha raccontato
la storia dei primi esperimenti che hanno
visto l’utilizzo delle piante come biofabbriche per la produzione di molecole
complesse di origine animale. Questi
risalgono alla fine degli anni ‘80, quando
Fig.1- Il plasmide Ti.
fu dimostrata la possibilità di esprimere
del genoma della cellula vegetale,
l’ormone della crescita, gli interferoni,
Come si rende una pianta
transgenica? Il plasmide Ti
l’albumina ed gli anticorpi funzionali
L’ingegnerizzazione delle cellule vegetali è
formazione di tumori del colletto. Il T-DNA
(Fischer and Emans 2000). Negli stessi
pratica non proprio banale. I motivi sono
altri non è che un segmento del ben più
anni fu anche dimostrata la possibilità
molteplici, uno su tutti la presenza di una
grande plasmide Ti (fig.1) presente nella
di produrre molecole antigeniche
parete cellulosica, intorno alla membrana
maggior parte dei ceppi di A. tumefaciens.
in cellule vegetali e fu sviluppato il
plasmatica, che costringe molte volte a
L’“ingaggio” di questo batterio nei confronti
concetto di “vaccino edibile”, cioè l’uso
dover lavorare con i cosiddetti protoplasti,
del suo bersaglio verde prevede prima
di parti commestibili delle piante per la
cellule vegetali private della parete.
di tutto la fissazione alla cellula vegetale,
somministrazione di un vaccino orale
La Natura ci ha però fornito di un
di solito in corrispondenza di una ferita
(Mason 2002).
organismo ad-hoc, che “per mestiere” è
aperta, e secondariamente, l’induzione
in grado di trasferire materiale genetico
dei geni della virulenza (denominati geni
alle cellule vegetali. Un “cavallo di Troia”
vir) presenti nel plasmide Ti stesso. Questi
benemerito che le moderne biotecnologie
geni posti al di fuori della regione T-DNA
hanno utilizzato ed utilizzano per far
sono indispensabili per il trasferimento
esprimere nelle cellule di molte piante
della suddetta regione dal batterio alla
proteine eterologhe. Il batterio del suolo
cellula vegetale. Il T-DNA viene trasferito
Gram-negativo Agrobacterium tumefaciens,
con un processo che ricorda da vicino
questo il nome del microrganismo in
la coniugazione batterica. La maggior
questione, è un fitopatogeno che trasforma
parte dei geni localizzati nella regione del
geneticamente le dicotiledoni con un
T-DNA viene attivata solo successivamente
processo che rientra nel suo normale
all’integrazione nel genoma della
ciclo vitale. In seguito a trasferimento,
cellula vegetale. L’attività neoplastica
integrazione ed espressione dei geni
di questo segmento di plasmide è
di un particolare segmento di DNA
perpetrata attraverso l’attivazione di vie
plasmidico del batterio, il T-DNA, all’interno
metaboliche che, da ultimo, portano
in cellule vegetali proteine umane come
Agrobacterium tumefaciens.
A. tumefaciens conduce la pianta alla
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Citochinine.
■
La sintesi delle Opine non è utile alla
pianta transgenica e potrebbe stornare
risorse da utilizzarsi nella produzione del
transgene.
■
I plasmidi Ti sono molto grandi (200-800
kb), il che consiglia l’eliminazione di tutte
le sequenze accessorie (inclusa la sequenza
vir) per rendere più snello il vettore di
clonaggio.
■
Il plasmide Ti nasce in A. tumefaciens
e non è dunque in grado di replicarsi
in E. coli senza l’aggiunta della corretta
sequenza di origine della replicazione.
Altri metodi di transgenesi
vegetale
E. coli.
Anche se in alcune specie i metodi mediati
all’overespressione dell’Auxina e delle
carbonio. Pur essendo degli straordinari
da A. tumefaciens hanno un’efficienza
Citochinine, potenti regolatori positivi della
veicoli naturali d’informazione genetica,
molto alta non tutte le piante si prestano
proliferazione cellulare e della crescita
questi plasmidi presentano delle limitazioni
ad essere trasformate in questa maniera,
della pianta. In questo particolare e quanto
che devono essere tenute in considerazione
in particolare le monocotiledoni tra le
mai interessante sistema il cerchio viene
prima di poter sfruttare il sistema per
quali i principali cerali come riso, frumento
chiuso dalla produzione, da parte della
l’ingegnerizzazione delle piante:
e mais. Per ovviare a questa limitazione
pianta trasformata, di inconsueti prodotti
■
di condensazione tra amminoacidi e
trasformate impediscono la rigenerazione
che si sta facendo sempre più spazio: la
chetoacidi o zuccheri (Opine) che vengono
della pianta matura. Ciò impone la
biolistica. Questo sistema prevede il vero
impiegati dal batterio come fonte di
rimozione dei geni dell’Auxina e delle
e proprio bombardamento dei tessuti
I fitormoni prodotti dalle cellule
vi è anche una seconda metodologia
vegetali con microproiettili d’oro o di
TABELLA 1  Metodi per ottenere piante transgeniche rispettive caratteristiche
tungsteno (diametro 0,4-1,2µm) rivestiti
con il DNA che si vuole trasferire. I proiettili
Metodo
Caratteristiche
penetrano le cellule vegetali depositando
Trasferimento genico mediato dal plasmide Ti
Sistema molto efficiente ma ristretto a pochi
tipi di piante.
il prezioso carico all’interno del nucleo,
Bombardamento biolistico
Applicabile ad un vasto numero di piante e di
tessuti; facile e poco costoso.
senza danneggiare in maniera significativa
le cellule. Anche se per il momento la
Vettori virali
Metodo poco efficace per introdurre il DNA nelle
cellule delle piante.
biolistica e le strategie che contemplano
Trasferimento diretto nei protoplasti
Applicabile solamente ai protoplasti delle piante che
si prestano ad essere rigenerate in piante vitali
maestre (perché più funzionali), esiste
Microiniezione
Limitata utilità perché si può iniettare una sola
cellula alla volta; esige elevate competenze
tecniche.
l’utilizzo del plasmide Ti restano le strade
un bacino di altre tecniche atte alla
trasformazione delle cellule vegetali. Queste
spaziano dall’utilizzo di infezioni virali alla
Elettroporazione
Limitata generalmente ai protoplasti delle cellule
vegetali rigenerabili in piante vitali.
microiniezione (tab.1).
Fusione dei liposomi
Applicabile solamente ai protoplasti delle cellule
delle piante che si prestano ad essere rigenerate in
piante vitali.
La giusta espressione
Come sottolineato anche da Cardi ad oggi
sono disponibili diverse tecnologie per
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inserire transgeni d’interesse nelle cellule
vegetali. Nei sistemi d’espressione transiente
il transgene non s’integra nel genoma e
non è quindi trasmesso alla generazione
successiva. Le metodiche di trasduzione
stabile invece prevedono l’integrazione
del transgene nel genoma nucleare o
plastidiale e la successiva trasmissione, con
modalità diverse, alla progenie (Fischer and
Emans 2000, Streatfield 2007). L’espressione
transiente di un transgene può essere
perseguita sia in una fase preliminare, per
saggiare costrutti diversi e le condizioni
migliori per l’accumulo della proteina, sia
come tecnologia di produzione vera e
propria.
Il principale vantaggio, infatti, è la velocità
con cui si ottengono i risultati (Leone et al.
l’uso di promotori tessuto-specifici o
compartimento ottimale per le modifiche
2008). Il livello d’espressione dei transgeni
inducibili consente la sintesi della proteina
post-traduzionali e la stabilità (Streatfield
solitamente non è elevato ma molti
ricombinante in tessuti o stadi di sviluppo
2007, Benchabane et al. 2008).
promotori ed altre sequenze regolatrici
diversi, mentre sequenze per l’indirizzamento
In alternativa, l’integrazione dei transgeni
sono note per ottimizzare i risultati. Inoltre,
subcellulare ne consentono l’accumulo nel
può essere ristretta ai soli genomi dei plastidi,
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con i seguenti vantaggi:
■
alto livello d’espressione;
■
trasduzione di geni multipli in operoni
di tipo procariotico, codificanti per vaccini
multimerici o molecole complesse;
■
biosicurezza (il polline della gran parte
delle piante superiori non contiene plastidi
funzionali);
■
limitato effetto negativo sul metabolismo
cellulare delle proteine sequestrate nei
plastidi.
Molte molecole con ampie potenzialità
d’utilizzo farmacologico sono state
VETTORI BASATI SUL PLASMIDE Ti
Esistono due diverse strategie per effettuare il trasferimento e l’integrazione della
regione T-DNA nella pianta di interesse. Un metodo prende vantaggio dall’utilizzo di
un sistema definito vettore binario che contiene sia l’origine di replicazione di E.coli,
sia quella di A. tumefaciens. Le varie fasi del clonaggio si effettuano tutte in E.coli e
poi si introduce il vettore in A. tumefaciens. In quest’ultimo è presente un plasmide Ti
definito disarmato, mancante cioè della regione T-DNA ma che possiede i geni vir. La
complementazione in trans di questi due plasmidi assicura il passaggio della sequenza
d’interesse alla cellula vegetale. Il secondo metodo si basa su un vettore definito
cointegrato. In questo caso il costrutto di clonaggio viene fatto ricombinare con un
plasmide Ti disarmato, grazie a sequenze di omologia che consentono tale processo.
In questo modo si ottiene un nuovo plasmide ricombinate del tutto competente per il
trasferimento genico.
recentemente prodotte nei plastidi, utilizzati
come bio-fabbriche, raggiungendo livelli di
espressione molto alti nel caso di subunità
o sul metodo di modificazione genetica
una volta sintetizzate, purificate prima
vaccinali e proteine terapeutiche (Daniell
che permetta il miglior risultato in assoluto.
della somministrazione. È evidente che
2006, Bock 2007). Numerose specie vegetali
Ogni valutazione è infatti strettamente
l’efficienza delle tecnologie impiegate
sono state utilizzate per la produzione di
dipendente dal tipo di sostanza desiderata
per la purificazione influenzino il livello
proteine ricombinanti. Allo stesso tempo
e dal contesto produttivo ed industriale di
finale di produzione, nonché il costo
sono stati valutati organi di accumulo diversi
specie (Leone et al. 2008). Similmente ai
complessivo. Tale livello è anche importante
o sistemi alternativi (es. colture idroponiche,
prodotti di origine naturale un livello minimo
per il concepimento di vaccini per la
colture di cellule in sospensione) (Fischer and
di espressione, di norma superiore all’1%
somministrazione orale, che pur richiedendo
Emans 2000, Ma et al. 2003, Twyman et al.
delle proteine totali solubili, è il fattore più
un minor grado di purificazione, devono
2003, Schillberg et al. 2005). Ad oggi non c’è
importante per la commercializzazione di
essere formulati in concentrazioni tali da
però consenso unanime sulla specie vegetale
proteine ricombinanti che devono essere,
rendere praticabile l’ingestione e, allo stesso
tempo, evitare fenomeni di tolleranza orale
(Streatfield 2007). Il livello di produzione
in planta delle proteine ricombinanti è
dunque strettamente dipendente dalle
caratteristiche intrinseche del sistema
scelto (biomassa per unità di superficie,
quantità di proteine totali prodotte), dal
livello di espressione del transgene e dalla
stabilità della proteina eterologa d’interesse
(Schillberg et al. 2005). In questo ambito le
biotecnologie vegetali hanno saputo ideare,
sviluppare e rendere operativi numerosi
approcci per ottimizzare i diversi aspetti citati
(Leone et al. 2008).
Biosicurezza
In tutti i settori d’avanguardia quello della
sicurezza è un tassello molto importante
in mosaici già di per se assai complicati.
Agrobacterium tumefaciens.
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In questo ambito il tema principale verte
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Nel caso del molecular farming gli organismi
METODOLOGIE INNOVATIVE DI TRANSGENESI
VEGETALE
L’industria biotecnologica “Medicago” utilizza l’agroinfiltrazione per produrre molecole
ricombinanti d’interesse farmaceutico a livello commerciale. Proprio in questo periodo
l’azienda Canadese sta sviluppando un vaccino basato su particelle virali (VLP) che sta
dando buoni risultati nei test pre-clinici (www.medicago.com/en/).
L’Americana SemBioSys sta attualmente testando, in fase di trial clinico, la
propria tecnologia di transgenesi per la produzione di insulina ricombinante e
dell’Apolipoproteina A1Milano. Tecnologie innovative, basate su vettori virali di nuova
generazione, sono state messe a punto presso la ICON Genetics (www.icongenetics.
com/html/home.htm), ottenendo livelli di produzione molto alti, (fino a 5 g per kg di
peso fresco, per più di 50 proteine d’interesse farmaceutico) (Gleba et al. 2007).
vegetali possono essere ingegnerizzati per
produrre proteine utili alla salute umana. Le
biotecnologie vegetali ci hanno mostrato
qual è la strada per utilizzare le piante come
“bioreattori verdi” in grado di migliorare la
produzione farmaceutica e di aprire nuove
interessanti prospettive di reddito per
l’agricoltura.
bibliografia
- Arntzen C., 2005. Plant-derived vaccines and antibodies:
potential and limitations. Vaccine 23, 1753-1756.
sul contenimento dei transgeni e dei
dei semi (tecnologia terminator) e molte
prodotti ottenuti mediante tecniche di
altre (Ma et al. 2005, Murphy 2007). Infine,
modificazione genetica. Cardi ci ha spiegato
per impedire la contaminazione delle filiere
che esistono innumerevoli sistemi di
alimentari, è stato proposto di impiegare,
controllo e contenimento. Una possibilità
per scopi di molecular farming, solo piante
è adottare sistemi di produzione chiusi in
no food/no feed. Oltre che l’allevamento
bioreattori, basati su colture di cellule in
in condizioni controllate e l’adozione dei
sospensione, di radici, o di piante acquatiche.
meccanismi di contenimento biologico
Per l’allevamento di piante d’interesse
su descritti, come ulteriore misura
agrario è invece necessario ricorrere ad
precauzionale, si possono anche adottare
aree remote e segregate o a serre. Per
sistemi di espressione inducibili e marcatori
ridurre al minimo la probabilità di diffusione
morfologici che consentano di “tracciare”
dei transgeni, sono state ideate diverse
le colture destinate al molecular farming,
tecnologie, come la trasduzione dei plastidi,
mantenendole separate dalle altre (Ma et al.
la trasformazione di piante maschiosterili o
2005, Murphy 2007). Modificare il genoma di
con geni che impediscono la germinazione
una pianta può voler dire moltissime cose.
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