L’IMPORTANZA DI DETERMINARE IL LIMITE DI DETECTION
DELLA FRAZIONE FETALE DELLE METODICHE DI SCREENING
PRENATALE NON INVASIVO
Francesco Fiorentino*, Sara Bono, Francesca Pizzuti, Martina Mariano, Arianna Polverari, Sara Duca,
Mariateresa Sessa, Marina Baldi, Laura Diano, Francesca Spinella.
La frazione fetale (FF), cioè la quantità di cell free (cfDNA) fetale rilevata nel campione di plasma analizzato
rispetto al cfDNA totale, è un parametro importante da determinare con l'esecuzione dei test NIPT, in quanto a
FF molto basse le aneuploidie potrebbero non essere rilevabili, e quindi produrre risultati falsi negativi.
Per ridurre tale rischio, alcune metodiche NIPT attualmente in uso utilizzano un cut-off del 4% di frazione
fetale. A valori di FF inferiori a tale cut-off, viene refertato un risultato non conclusivo a causa di bassa quantità
di DNA fetale e viene richiesto un nuovo prelievo. In questo studio ci siamo proposti di individuare il valore
minimo di FF, definito come Limit Of Detection (LOD), a cui una metodologia NIPT basata sul
sequenziamento massivo parallelo (Massively Parallel Sequencing, MPS) è in grado di identificare una
aneuploidia cromosomica.
Per definite il LOD è stato usato un modello sperimentale di campioni contenenti diverse concentrazioni di FF
ottenute mescolando campioni di plasma euploidi e aneuploidi a frazioni fetali note. Determinato un LOD di
FF> 2% LOD, sono stati analizzati 7103 prelievi ematici di donne che si sottoponevano allo screening per le
aneuploidie fetali comuni. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la tecnologia adottata è capace di rilevare la
presenza di feti con trisomia (T) 21, T 18 e T13 in campioni di sangue con livelli di FF uguale o superiori al
2%. Tra i campioni analizzati 105 erano aneuploidi e di questi 25 (23.8%) avevano una FF compresa tra il 2%
ed il 4%. In questi campioni l’incidenza delle aneuploidie era significativamente più elevata rispetto a quella dei
campioni con FF ≥4% (23,8% vs. 1.1%; p=0.001). La sensibilità del test sul cfDNA per le T21, T18, T13 è stata
del 100%, con una specificità del 99.99% per T21 e T18, e del 100% per T13. I risultati di questo studio
dimostrano che la definizione di uno specifico LOD permette di identificare un elevato numero di aneuploidie
(23.8%) non rivelabili utilizzando un limite arbitrario del 4%.
Queste aneuploidie possono essere identificate con un elevato grado di accuratezza, limitando il numero di
cancellazioni e/o ripetizioni del test. Lo studio suggerisce di riconsiderare il limite attuale di FF e di calcolarne
quello reale per ciascuna specifica metodologia NIPT adottata per lo screening delle aneuploidie fetali.
INTRODUZIONE
Il test prenatale non invasivo (Non-Invasive Prenatal
Testing NIPT), basato sull’analisi del DNA di origine
fetale libero, (cell-free DNA, cfDNA), circolante nel
plasma materno è stato rapidamente integrato nella
pratica clinica per il rilevamento delle aneuploidie
fetali comuni, come la trisomia (T) 21 la T18 e la
T131.
L’elevata sensibilità e specificità delle diverse
metodologie NIPT, dimostrata da molteplici studi
clinici2 e dall'approvazione al suo uso da parte delle
organizzazioni professionali mediche, ha portato
all’adozione della NIPT come tecnica ordinaria per lo
screening delle aneuploidie nelle gravidanze ad alto
rischio.3-7
Per l’analisi delle aneuploidie mediante NIPT si
utilizzano differenti metodologie basate sulle
tecniche di sequenziamento di seconda generazione
“Next-Generation Sequencing, NGS”, che prevedono
il sequenziamento dell’intero genoma attraverso il
“Massive Parallel Sequencing, MPS8-10”, o di
specifiche regioni o polimorfismi di singoli
nucleotidi (SNP)11,12. Inoltre, negli ultimi anni si è
assistito ad una considerevole diminuzione dei costi
delle analisi che ha favorito l'ampia diffusione di
questi sistemi. I risultati emersi dai diversi trials
hanno mostrato un'elevata efficacia della tecnologia
nella definizione di queste cromosomopatie, in
particolare nella determinazione della trisomia 21
(T21).
Queste metodologie si basano sulla capacità di
rilevare incrementi proporzionali del cfDNA fetale
rispetto a quello materno largamente più rappresento.
Il plasma materno contiene percentuali variabili di
FF, che differiscono nei diversi campioni. La FF
media riscontrabile nel plasma di una donna alla XXX settimana di gravidanza, è di circa il 10% 11-15, e
può variare tra <4% ed il 40%. Indipendentemente
dalla metodologia applicata, la possibilità di ottenere
un risultato valido è principalmente correlato alla
proporzione della FF.
La FF è un valore determinante dell’accuratezza
dell’analisi16-17. In presenza di una gravidanza in cui
è presente un feto con una trisomia, il cfDNA
derivante dal cromosoma in eccesso aumenterà la
proporzione del cfDNA fetale per quel cromosoma
rispetto alla proporzione di cfDNA atteso in
condizioni di gravidanze normali di riferimento.
1
Indirizzo: GENOMA - Molecular Genetics Laboratory, Via di Castel Giubileo, 11
00138 Rome, Italy
La capacità di rilevare l’incremento della quantità di
cfDNA fetale per un determinato cromosoma, e
quindi l’aneuploidia, è direttamente correlato con la
FF18-20. Se nel sangue materno è presente una
quantità sufficiente di FF, l’analisi produrrà una
conta accurata dei frammenti circolanti aggiuntivi
rilasciati dal cromosoma soprannumerario del feto.
La capacità di distinguere gravidanze aneuploidi da
quelle euploidi è più elevata nei campioni con
quantità maggiore della FF. Nei casi con alti valori
della FF il test avrà una migliore performance. Al
contrario, se la FF è troppo bassa la presenza di una
aneuploidia
potrebbe
essere
mascherata
dall’eccessiva quantità di cfDNA materno euploide,
aumentando il rischio di ottenere falsi negativi16.
Per questo motivo, molti degli attuali test clinici
richiedono che, per un accurato risultato del test, sia
presente nel sangue materno un livello definito di FF.
Il valore minimo di FF comunemente adottato è di
circa il 4%. Al di sotto di questo valore il risultato
non viene considerato attendibile e la risposta viene
indicata come fallimento del test14,17,18
Il valore minimo del 4% è stato definito mediante
modelli statistici basati sul numero minimo di letture
dei frammenti del cromosoma aneuploide sufficiente
per evidenziare l’aneuploidia fetale in funzione di
diversi livelli di FF 16,17,19.
Secondo questo modello, a bassi livelli di FF, le
differenze nel cfDNA circolante tra gravidanze con
trisomie fetali e gravidanze con feti euploidi
potrebbero non essere rilevato 13, 20, 21, causando falsi
negativi.
Nonostante molti test adottino un valore della FF>4%
per assicurare una elevata attendibilità ed un ridotto
numero di insuccessi o fallimenti, ad oggi non sono
stati effettuati studi per verificare il reale limite
minimo di rilevamento, limit of detection (LOD), cioè
il valore più basso di FF al quale una specifica
metodologia possa identificare una aneuploidia
fetale.
Questo studio si propone di determinare il LOD
dell’analisi NIPT basata sulla tecnologia MPS e
valutarne la specificità e sensibilità in pazienti con
una FF<4%.
Materiali e metodi
Disegno dello studio.
Lo studio è stato organizzato in tre fasi. Nella prima,
è stato eseguita una analisi retrospettiva su campioni
di plasma congelato ottenuto da donne che si erano
sottoposte alla diagnosi prenatale invasiva. I
campioni sono stati analizzati applicando una
metodologia NIPT basata sul MPS. I risultati sono
stati confrontati con quelli ottenuti dall’analisi del
cariotipo fetale mediante test prenatali invasivi
(villocentesi o amniocentesi). Lo scopo è stato quello
di definire i parametri NIPT di classificazione dei
campioni euploidi ed aneuploidi. Nella seconda fase,
è stato realizzato un modello sperimentale di
campioni con differenti percentuali di FF, compresi
tra 1% e 4%. A questo scopo campioni aneuloidi con
una FF nota sono stati diluiti con campioni euploidi
con la stessa FF. I campioni ottenuti, contenenti
ciascuno una diversa percentuale di FF, sono stati
analizzati usando la metodologia NIPT basata su
MPS con l’obbiettivo di stabilire il LOD per ciascuna
aneuploidia fetale. Nell’ultima fase il protocollo
NIPT è stato applicato per l’analisi clinica di 7103
campioni di donne in gravidanza che richiedevano
una analisi NIPT su cfDNA. Lo scopo è stato quello
di stabilire l’accuratezza del test in campioni con
FF<4%.
Preparazione dei campioni, sequenziamento e
classificazione dei risultati.
I campioni di plasma sono stati processati per
l’estrazione del cfDNA mediante in kit QIAamp
DNA Blood Mini Kit (Qiagen) seguendo il
protocollo indicato.
Dopo aver ottenuto delle librerie geniche mediante il
kit TruSeq nano Kit (Illumina) dal cfDNA estratto
dal plasma materno, i frammenti di cfDNA, sono stati
processati usando il sequenziatore HiSeq2500
(Illumina). Lo strumento ha generato una media di 16
milioni di letture per campione su specifiche zone
dell’intero genoma. Il numero di queste letture è stato
confrontato con il valore ottenuto da un genoma
euploide di riferimento. I dati sono stati analizzati
mediante l’algoritmo SAFeRTM (Illumina), che
allineando il numero di letture con un cromosoma di
riferimento (hg19, ottenuto dal database UCSC) ha
prodotto una misura statistica chiamata “Normalized
Chromosome Value” (NCV) per il cromosoma 13, 18
e 21.
Il valore NCV è basato sull’analisi della ratio (R)
cioè del rapporto tra il numero normalizzato di lettura
dei frammenti del cromosoma da testare (test) e
quello del cromosoma di riferimento (reference), e
rappresenta la deviazione standard della differenza
dalla media della ratio (R) di un campione diploide.
Il valore NCV per ciascun campione (k) e
cromosoma (i) viene calcolato come segue10:
ππΆπππ =
π
ππ − π
π’π
ππ’π
in cui σui è la deviazione standard ottenuta da un set
di campioni con soli cromosomi euploidi
(u=unaffected). La media della ratio (Rui) per il
valore di un cromosoma euploide viene calcolata
dallo stesso campione euploide. Il valore di Rki per i
cromosomi 21, 18, 13, X and Y è determinata
individualmente per ciascun cromosoma. L’NCV
minimizza le variazioni presenti all’interno e tra le
diverse sequenze, ed è stato utilizzato per la
successiva classificazione dei campioni clinici in
esame in questo studio.
Seguendo i criteri comunemente adottati nei
laboratori che eseguono NIPT mediante analisi
cfDNA22,23 i campioni sono stati classificati in base ai
valori di NCV per ciascun cromosoma secondo la
seguente classificazione:
ο· “affetto” o aneuploide per un valore di NCV
≥4;
ο· “non affetto” o euploide per un valore di
NCV <3;
ο· con “sospetta aneuploidia” per un valore
3<NCV<4.
Per la classificazione del sesso sono stati usati i
seguenti parametri22:
ο·
ο·
ο·
femmina se per il cromosoma X, il valore è
-2.5<NCV<2.5 e per il cromosoma Y, il
valore di NCV è <2.5;
maschio se, per il cromosoma X, il valore è
NCV è <-4 e per il cromosoma Y, NCV è
>33;
se i valori di NCV per X e Y non rientrano
in queste categorie , il campione viene
indicato come non classificabile per il sesso.
Misurazione della Frazione Fetale
La frazione fetale (FF) è stata stabilita in base al
conteggio dei frammenti cromosomici ottenuti
mediante MPS (MPS tag-count) per il cromosoma X,
in campioni con feto maschile, e/o per il cromosoma
aneuploide nei campioni con feto aneuploide, come
riportato in precedenti studi 24.
Per la determinazione della FF nei campioni
aneuploidi è stata applicata la seguente formula24:
πΉπΉ = 2π₯ |
π
π΄π
−1|
π
π’π
In cui RAi è la ratio per un cromosoma affetto
(non euploide) i e Ru è la ratio per il cromosoma non
affetto (euploide) i.
Per la determinazione della FF nei maschi, è
stata usata la seguente formula:
πΉπΉ = 2π₯ |1 −
π
π΄π₯
π
π’π₯
|
In cui RAx è la ratio per il cromosoma X nei campioni
maschi (una copia del cromosoma X) and Rux è la
ratio per il cromosoma X nelle femmina (2 copie del
cromosoma X).
Il metodo non può essere usato per la quantificazione
della FF per campioni ematici di donne con feti
normali femmine25.
Consulenza prenatale
Tutti i pazienti che si sono sottoposti a NIPT hanno
ricevuto una consulenza prenatale da parte di un
genetista del nostro centro. Durante la consulenza
prenatale sono state analizzate le motivazioni del
ricorso dei pazienti allo screening; sono stati fornite
le informazioni sul protocollo NIPT, fornendo i dati
sulla sensibilità, specificità e valore predittivo del
test. I potenziali rischi e benefici del test NIPT sono
stati ampiamente esposti offrendo anche le varie
opzioni per test alternativi. Inoltre, è stato offerto una
consulenza post-test in tutti quei casi in cui è stata
evidenziata una aneuploidia cromosomica. Il
consenso informato è stato firmato da tutte le pazienti
che si sono sottoposte all’analisi.
Lo studio è stato approvato dalla commissione di
revisione interna del laboratorio Genoma.
Risultati
Definizione dei parametri di classificazione (studio
retrospettivo).
Per lo studio retrospettivo sono stati analizzati 2006
campioni di plasma, di cui 2000 (99.7%) rispettavano
i parametri metrici di qualità e hanno ricevuto un
risultato. Le caratteristiche dei pazienti inclusi in
questa analisi sono descritte nella tabella
supplementare 1.
I valori di NCV ottenuti con l’analisi NIPT sono stati
confrontati con i risultati del follow up delle pazienti.
Come mostrato nel grafico della figura 1, 1969 su
2000 campioni diagnosticati con un cariotipo fetale
normale avevano un valore di NCV compreso tra -3.5
e 3.55.
Dei restanti campioni diagnosticati con un cariotipo
aneuploide (n=31), quelli con trisomia 21 (T21,
n=25) mostravano un NCV tra 6.5 e 11.8, quelli con
T18 (n=4) mostravano un NCV tra 6.5 and 11,8, e
quelli con T13 un NCV di 7.7 e 24.7 (Figura 1). Il
99.8% dei campioni euploidi mostrava un NCV
minore di 3, mentre nell’87% dei campioni il valore
di NCV era maggiore di 4. Quattro campioni euploidi
e 4 aneuploidi avevano un NCV compreso tra 3 e 4.
Sulla base dei parametri di classificazione
attualmente adottati dai laboratori che eseguono
questo tipo di screening, i campioni con NCV>4 sono
stati classificati come aneuploidi, e quelli con NCV<3
euploidi.
Un’attenta analisi di questi risultati ci ha permesso di
adattare i valori di soglia euploide/aneuploide,
usualmente 2.5<NCV<3, ad un valore compreso tra 3
e 4. Questo ha permesso di mantenere un margine di
sicurezza per tutti quei campioni i cui valori ottenuti
erano borderline, cioè al limite tra quelli aneuploidi
ed aneuploidi. Di conseguenza per quei campioni con
un valore di NCV compreso tra 3 e 4, i risultati sono
stati riportati come casi con “sospetta aneuploidia”.
Questi tre campi di valori NCV sono stati adottati per
la classificazione dei campioni analizzati nello studio
prospettico.
Determinazione del LOD
Per determinare il limite minimo di FF al quale è
possibile identificare una aneuploidia, sono stati
analizzati una serie di 156 campioni con diversi livelli
di
FF
ottenuti
sperimentalmente
(Tabella
Supplementare 2). I valori di NCV per i cromosomi
21, 18 e 13 ottenuti da ciascun campione sono stati
correlati con la percentuale di FF. L’analisi ha
dimostrato che i valori di NCV e FF correlavano
linearmente e che tutti i campioni con una percentuale
di FF>2% avevano un valore di NCV>3. In
particolare, i risultati hanno evidenziato che il
campione con il più basso valore di NCV per il
cromosoma 21 aveva una FF di 2%, per il cromosoma
18 una FF di 1.5%, e per il cromosoma 13 di 1,68
(Figure 2). Questi risultati hanno dimostrato che il più
basso valore al quale tutte e tre le aneuploidie sono
state identificate era del 2%. Questo valore è stato
identificato come LOD ed utilizzato nelle analisi
successive.
Applicazione clinica del LOD (studio prospettico)
Per questo studio sono stati analizzati 7103 campioni
di plasma materno. Le caratteristiche dei pazienti
sono elencati in Tabella 1. L’età media dei
partecipanti allo studio era di 36.4±4.7 e l’età
gestazionale era compresa tra 10 settimane e 30
settimane (media 12.8 settimane ±2.3 giorni). Dei
7103 campioni raccolti, 21 (0.3%) non rientravano
nei parametri metrici di qualità del test e 7082 sono
stati processati e hanno dato un risultato.
Dall’analisi dei dati si evince che il 99.9% dei
campioni con un cariotipo fetale normale avevano un
NCV compreso tra -3 e +3, mentre il 100% dei
campioni aneuploidi avevano un NCV>3. In
particolare, i campioni con una Trisomia 21 (T)21
(n=77) avevano un NCV compreso tra 3.18 e 33,
quelli con T18 (n=21) avevano un NCV compreso tra
6.5 e 11.8, e quelli con T13 (n=9) avevano un NCV
compreso tra 7.7 e 24.7.
Inoltre, sono stati identificati 10 campioni con
3<NCV<4 classificati come casi con “aneuploidia
sospetta”. I risultati dell’analisi del cariotipo
molecolare ottenuti dalla diagnosi prenatale invasiva,
hanno confermato che 8 di questi casi con
“aneuploidia sospetta” erano aneuploidi. Mentre due
casi con “aneuploidia sospetta”, uno con T21 ed uno
con T18 con un valore di NCV rispettivamente di 5.2
e 5.03, sono stati diagnosticati dall’analisi invasiva
“non-affetti” (Figura 3). In totale 105 campioni su
107 trisomici sono stati confermati dai risultati del
cariotipo fetale ottenuto mediante analisi prenatale
invasive.
a
b
Tra i campioni con un risultato, 79 (1.1%) sono stati
cancellati per insufficiente quantità di cfDNA fetale
(FF<2%) (Tabella 2).
I valori di NCV ottenuti dal test per il cromosoma 21,
18 e 13 sono mostrati in Figura 3.
“cariotipo fetale mediante diagnosi prenatale invasiva”
età >35 anni
a, Fallimento dei criteri metrici del test;
b Cariotipo fetale confermato da test prenatali invasivi.
Nessun falso negativo è stato rilevato. La sensibilità
del test è stata del 100% per T21, T18 e T13. La
specificità è stata del 99.98% per T21 e T18 e del
100% per T13 (Tabella 3).
Calcolo dell’accuratezza del test in campioni con
bassa livelli di FF
Per analizzare l’influenza dei campioni con bassi
livelli di FF nella performance del test basato sul
rilevamento del cfDNA, i campioni aneuploidi sono
stati divisi in base ai livelli di FF. Come mostrato
nella figura 4A, delle 105 aneuploidie confermate, 25
(23.8%) avevano una FF compresa tra il 2% ed il 4%
(Tabella 2 e Figura 4). In particolare, 17 aneuploidie
sono state identificati come T21, 3 come T18 e 5
come T13 (Tabella 2 and Figure 4). Queste
aneuploidie non sarebbero state rilevate se il test
avesse usato come limite minimo il valore di FF>4%.
L’analisi statistica di questi dati ha dimostrato che
esiste un incremento di circa 6-volte (p>0.001)
dell’incidenza delle aneuploidie nei campioni con
una 2%<FF<4% versus quelli con una FF>4%
(Tabella 4).
All’interno del gruppo con 2%<FF<4%, sono stati
identificati 2 falsi positivi, un caso con T18 ed un
caso con T21 (Tabella 4 e Figura 4).
Per calcolare l’incidenza delle aneuploidie nel gruppo
di pazienti con una FF<4% rispetto a quelle con una
F>4%, l’analisi è stata limitata ai pazienti con feti
maschi. Tra questi il 93% aveva una frazione fetale
>4% e 310 (8.5%) una FF<4% di cui 231 (6.4%) con
una 2%<FF<4% e 79 (2.2%) FF<2% (Tabella 4 e
Figura Supplementare 1A). Per tutti questi campioni
con una FF<2% è stato effettuato un secondo prelievo
e tutti sono stati correttamente diagnosticati normali.
L’incidenza delle aneuploidie tra i campioni con una
FF>4% era dell’1.1% (36/3318), mentre quella dei
campioni con 2%<FF<4% era 6.9% (16/231)
(Tabella 4 e Figura Supplementare 1B)
Discussione
Un potenziale limite alla prospettiva di offrire lo
screening delle principali aneuploidie autosomiche
mediante NIPT, come metodo routinario nella pratica
clinica, è rappresentato dalla possibilità di ottenere un
fallimento del test, dovuto principalmente alla
presenza di bassi livelli di frazione fetale nel sangue
materno. Infatti, mentre i metodi convenzionali di
screening riportano solo rari casi di fallimento, le
metodologia basate sul rilevamento del cfDNA
riportano nell’1-8% dei casi un fallimento o
cancellazione del test dovuto ai bassi livelli di cfDNA
fetali.
La frazione fetale tipicamente aumenta con l’età
gestazionale ed è negativamente correlata con il peso
materno 15,16,26.
La probabilità di insuccesso, o fallimento, del test
dipende dalla possibilità del metodo di misurare o
meno la FF dal limite minimo della FF applicato dalla
metodologia e in parte, dalla profondità di lettura
adottata dal metodo. 2,11,13,14,22,23,27-30. In molti
laboratori il valore minimo di FF richiesto per un
rilevamento accurato del test su cfDNA è il 4%16,17. I
risultati ottenuti in campioni con valori di FF inferiori
del 4% sono considerati non attendibili e vengono
riportati come “risultato non informativo” o
“fallimento del test”. In questo studio la validazione e
applicazione clinica del protocollo NIPT con un
valore limite della FF del 2%, ha permesso di
identificare 25 (23.8%) aneuploidie in cui la FF era
compresa tra il 2 ed il 4% con alti livelli di
accuratezza del test. Queste pazienti con un alto
rischio di aneuploidie non sarebbero state identificate
utilizzando il limite del FF>4%. Questi risultati
indicano che con la metodologia NIPT è possibile
eseguire il test anche su campioni con bassi livelli di
cfDNA fetale senza ridurre l’accuratezza dello
screening delle aneuploidie fetali basato sul cfDNA
circolante. Infatti, dall’applicazione clinica del test
non è stato ottenuto nessun falso negativo.
Inoltre i valori di sensibilità e specificità del test non
sono stati influenzati dalla presenza di campioni con
bassi livelli di FF.
L’applicazione di un protocollo NIPT capace di
analizzare con accuratezza anche campioni con bassi
livelli di FF offre numerosi vantaggi. Uno dei più
importanti è quello di poter ridurre il numero delle
cancellazioni del test e di conseguenza abbassare
l’incidenza delle ripetizioni del prelievo del sangue
materno. Infatti, l’8.5% dei campioni con una FF<4%
analizzati in questo studio, sarebbero stati riportati
senza alcun risultato se si fosse adottato il limite
comunemente usato da altri laboratori. Applicando il
limite ottenuto dagli esperimenti di LOD, è stato
possibile ridurre al 2.2% il numero dei casi con
nessun risultato e di conseguenza delle ripetizioni del
test.
Nonostante la ripetizione del test rappresenti una
delle scelte a cui il paziente può rivolgersi in caso di
fallimento del test dovuto a bassi livelli di FF, questo
potrebbe allungare i tempi dello screening e ritardare
la diagnosi di una eventuale aneuploidia. In
considerazione del fatto che solo nel 50-60% dei casi
la ripetizione del test garantisce un risultato 3,15,27,29,31,
un fallimento del test potrebbe ridurre le potenzialità
riproduttive del paziente.
Una metodologia NIPT capace di ottenere accurate
risultati anche a basse livelli di frazione fetale
potrebbe rappresentare una valida strategia per quelle
pazienti in sovrappeso 15,17,26. Infatti uno dei fattori
associati alle basse percentuale di cfDNA fetale, con
la conseguente possibilità di fallimento del test, è un
aumentato peso corporeo materno. L’aumentata
quantità del cfDNA materno in donne obese
potrebbe, infatti, mascherare la frazione fetale
rendendo difficoltoso lo screening delle aneuploidie.
Quindi, nelle donne in forte sovrappeso l’utilizzo di
una metodologia NIPT capace di rilevare anche basse
FF, potrebbe ridurre le possibilità di un fallimento del
test mantenendo un alto grado di accuratezza e
rappresentare quindi una opzione alle comuni
metodologie di screening basate su cfDNA fetale
maggiore del 4%.
In quei casi in cui è stato registrato un fallimento del
test a causa dei bassi livelli di frazione fetale è stato
osservato un significativo aumento dell’incidenza
delle aneuloidie fetali. Recentemente Norton et al.29
hanno riportato la presenza di aneuploidie
cromosomiche nel 4.7% delle gravidanze che a causa
dei livelli di FF<4% non avevano dato un risultato,
mentre nei campioni in cui era stato riportato un
risultato i casi con aneuploidia fetali erano dello
0.4%, riportando un incremento di circa 10 volte
dell’incidenza delle aneuploidie. Risultati simili sono
stati ottenuti da Pargament et al. 27, i quali riportano
che nei campioni con bassi livelli di FF le possibilità
che siano presenti delle aneuploidie è 4 volte
superiore rispetto ai campioni con una FF>4%. In
questo studio è stato rilevato un incremento
dell’incidenza delle aneuploidie pari a 6 volte (6.8%
vs 1.1%, p<0.001) nei campioni con 2%<FF<4% in
confronto ai campioni con una FF>4%.
Questi risultati confermano che una bassa frazione
fetale è associata ad un aumentato rischio di
aneuploidie fetali e sottolineano l’importanza di
analizzare anche quei campioni con una FF<4%,
adottando metodologie NIPT accurate anche in
presenza di casi con bassi livelli di frazione fetale.
I risultati riportati da questo studio sottolineano
anche l’importanza di come gestire le gravidanze che
presentano queste caratteristiche 3-5,32. Infatti la
decisione delle strategie da adottare nei casi in cui
non si ottengano risultati a causa della bassa FF, sono
diverse e dipendono da una serie di fattori come l’età
materna, le risposte dei test dei markers plasmatici,
cosi come dalla preferenza del paziente. In ogni caso
prima di procedere con un secondo prelievo,
considerando le basse probabilità di successo, nei
comuni protocolli viene offerta, alle donne che non
hanno avuto nessun risultato dalla NIPT, l’opzione di
un test diagnostico invasivo. Un’alternativa potrebbe
essere quella di usare la metodologia NIPT con
relativo LOD applicando una maggiore profondità di
sequenziamento19.
É importante notare che la performance della
maggior parte dei protocolli NIPT è calcolata sui
campioni che hanno una minima quantità di FF. La
dimostrazione di una aumentata incidenza delle
aneuploidie fetali in quei campioni con FF<4%
suggerisce che questi campioni dovrebbe essere
inclusi nel calcolo della performance di un test.
Infatti, se i casi esclusi perché con bassa FF fossero
stati considerati nella valutazione dell’accuratezza del
protocollo NIPT, avrebbero abbassato l’incidenza di
rilevamento del test, riportando un risultato più reale
del calcolo della performance del test30.
Bibliografia
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Tabella Supplementare 1. Caratteristiche dei pazienti (studio
retrospettivo)
Caratteristiche
N. dei campioni analizzati
n
2006
Età materna- anni
-
Media ±DS
-
Minimo-massimo
36.9±4.4
26-45
Età gestazionale al prelievo -settimana
-
Media ±DS
-
Minimo-massimo
Campioni con un risultato n.
12.9±2.3
11-22
2000
Cancellazioni del test (%)a
6 (0.3)
N. dei campioni aneuploidi (%)
31 (1.6)
-
T 21
25
-
T 18
4
-
T 13
2
Indicazioni per la NIPTa
-
Ansietà
230
-
Età materna avanzatab
1000
-
Screening prenatale positivo
110
-
Positività a test ecografici
20
-
Precedente gravidanza con feto aneuploide
30
-
Più di una delle precedenti indicazioni
610
Tabella Supplementare 2. Campioni sperimentali usati per la determinazione del LOD
FF
T 13
T 18
T 21
N. dei campioni
N. dei campioni
N. dei campioni
0%
6
6
14
1%
6
6
14
2%
6
6
14
3%
6
6
14
4%
6
6
14
8-13%
6
6
14
Totale
36
36
84
FF >4%
93,5%
FF<4%
8,7%
2% < FF < 4%
6,5%
FF < 2%
2,2%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
FF >4%
1,1%
FF<4%
5,1%
2% < FF < 4%
FF < 2%
***
6,8%
0,0%
0,0%
2,0%
4,0%
6,0%
8,0%
Figura Supplementare 1. Distribuzione campioni clinici maschi in base alla FF
(A) Il grafico mostra la frequenza relative dei campioni euploidi ed aneuploidi in base alla
percentuale di FF. (B) Il grafico rappresenta l’incidenza delle aneuploidie nei campioni in
base alla loro percentuale di FF. L’analisi ha rilevato un incremento statisticamente
significativo (***p<0.001) di circa 6-volte dell’incidenza delle aneuploidie nei campioni con
una 2%<FF<4% rispetto a quella con una FF>4%.
