tecniche molecolari.

TECNICHE MOLECOLARI
Poiché la fine del 1950 e primi anni 1960, i biologi molecolari hanno imparato a caratterizzare,
isolare e manipolare le componenti molecolari delle cellule e organismi. Questi componenti
includono il DNA, il repository di informazioni genetiche; RNA, un parente stretto del DNA, le
cui funzioni vanno da servire come una copia temporanea di lavoro di DNA alle effettive
funzioni strutturali ed enzimatiche così come una parte funzionale e strutturale dell'apparato
traslazionale, e proteine, il tipo strutturale importante e enzimatica della molecola nelle cellule.
Espressione clonazione
Una delle tecniche più basilari della biologia molecolare per lo studio della funzione delle
proteine è la clonazione di espressione. In questa tecnica, il DNA che codifica per una proteina
di interesse viene clonato (usando la PCR e / o gli enzimi di restrizione) in un plasmide (noto
come un vettore di espressione). Questo plasmide può avere elementi del promotore speciale
per guidare la produzione della proteina di interesse, e può anche avere marcatori di resistenza
agli antibiotici per seguire il plasmide.
Questo plasmide può essere inserito in nessuna delle due cellule batteriche o animali.
Introduzione di DNA in cellule batteriche può essere effettuata mediante la trasformazione
(tramite assunzione di DNA nudo), coniugazione (tramite contatto cellula-cellula) o trasduzione
(tramite vettore virale). Introduzione di DNA in cellule eucariotiche, come le cellule animali,
con mezzi fisici o chimici si chiama trasfezione. Diverse tecniche di transfezione differenti sono
disponibili, come la transfezione di calcio fosfato, elettroporazione, microiniezione e
transfezione liposoma. DNA può anche essere introdotto nelle cellule eucariotiche con virus o
batteri come vettori, la seconda è a volte chiamata bactofection e in usi particolari
Agrobacterium tumefaciens. Il plasmide può essere integrato nel genoma, con un conseguente
transfezione stabile, o può rimanere indipendenti del genoma, chiamata trasfezione transiente.
In entrambi i casi, il DNA che codifica per una proteina di interesse è ora all'interno di una
cella, e la proteina può ora essere espresso. Una varietà di sistemi, come promotori inducibili e
specifici fattori di segnalazione cellulare, sono a disposizione per contribuire a esprimere la
proteina d'interesse a livelli elevati. Grandi quantità di una proteina può quindi essere estratto
dalle cellule batteriche o eucariotiche. La proteina può essere sottoposto alla prova dell'attività
enzimatica sotto una varietà di situazioni, la proteina può essere cristallizzata così la sua
struttura terziaria può essere studiata, o, in industria farmaceutica, l'attività di nuovi farmaci
contro la proteina può essere studiato.
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
La reazione a catena della polimerasi è una tecnica estremamente versatile per la copiatura del
DNA. In breve, la PCR permette una singola sequenza di DNA da copiare (milioni di volte), o
alterate in modo predeterminato. Ad esempio, la PCR può essere utilizzata per introdurre i
luoghi degli enzimi di restrizione, o di mutare (cambiare) basi di DNA particolare, quest'ultimo
è un metodo denominato "cambio rapido". La PCR può anche essere usato per determinare se
un particolare frammento di DNA si trova in una libreria di cDNA. PCR ha molte varianti, come
la PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) per l'amplificazione di RNA, e, più recentemente, realtime PCR (QPCR) che consentono la misurazione quantitativa di molecole di DNA o RNA.
Gel elettroforesi
elettroforesi su gel è uno degli strumenti principali della biologia molecolare. Il principio di base
è che il DNA, RNA e proteine possono essere separate per mezzo di un campo elettrico. In gel
elettroforesi, DNA e RNA possono essere separati in base a dimensione, eseguendo il DNA
attraverso un gel. Le proteine possono essere separate in base alle dimensioni utilizzando un
gel SDS-PAGE, o sulla base della dimensione e della loro carica elettrica, utilizzando ciò che è
conosciuto come un elettroforesi su gel 2D.
Macromolecola blotting e sondaggio
I termini''''settentrionale, occidentale''''e''orientali''blotting sono derivati da quello che
inizialmente era uno scherzo della biologia molecolare che ha giocato sul termine''''Southern
blotting, dopo che la tecnica descritta da Edwin Southern per l'ibridazione del DNA cancellati.
Patricia Thomas, sviluppatore della macchia RNA che poi divenne nota come la''macchia''del
nord in realtà non ha usato il termine. Altre combinazioni di queste tecniche prodotte termini
come southwesterns''''(ibridazioni proteina-DNA),''''northwesterns (per rilevare le interazioni
proteina-RNA) e farwesterns''''(interazioni proteina-proteina), ognuno dei quali sono
attualmente in letteratura.
Southern blotting
Prende il nome dal suo inventore, biologo Edwin Southern, la macchia del sud è un metodo per
il rilevamento della presenza di una specifica sequenza di DNA in un campione di DNA.
campioni di DNA, prima o dopo enzimi di restrizione sono separati mediante elettroforesi su gel
e poi trasferito su una membrana tamponando con un'azione capillare. La membrana è quindi
esposto ad una sonda di DNA marcato che ha un complemento sequenza base alla sequenza
del DNA di interesse. La maggior parte dei protocolli originali utilizzati etichette radioattivi, le
alternative comunque non radioattivo sono ora disponibili. Southern blotting è meno
comunemente usato in laboratorio scientifico grazie alla capacità di altre tecniche, come la
PCR, per individuare specifiche sequenze di DNA da campioni di DNA. Queste macchie sono
ancora utilizzati per alcune applicazioni, tuttavia, come la misurazione numero transgene copia
in topi transgenici, o nella progettazione di linee di staminali embrionali gene cellule knockout.
Northern blotting
Il Northern blot viene utilizzato per studiare il pattern di espressione di un particolare tipo di
molecola di RNA come confronto relativo tra un insieme di diversi campioni di RNA. Si tratta
essenzialmente di una combinazione di denaturazione elettroforesi su gel di RNA, e una
macchia. In questo processo l'RNA è separato in base alle dimensioni e viene poi trasferito su
una membrana che viene sondato con una etichetta complemento di una sequenza di
interesse. I risultati possono essere visualizzati attraverso una varietà di modi a seconda
dell'etichetta utilizzata, tuttavia, la maggior parte comportare la rivelazione di bande che
rappresentano le dimensioni del RNA rilevati nel campione. L'intensità di queste bande è legato
alla quantità di RNA bersaglio nei campioni analizzati. La procedura è comunemente usato per
studiare quando e quanto espressione genica si verifica misurando la quantità di RNA che è
presente in diversi campioni. E 'uno degli strumenti più elementari per determinare in quale
momento, e in quali condizioni, alcuni geni sono espressi nei tessuti viventi.
Western blotting
Anticorpi anti maggior parte delle proteine possono essere creati iniettando piccole quantità di
proteina in un animale come un topo, coniglio, pecora, o un asino (anticorpi policlonali) o
prodotti in colture cellulari (anticorpi monoclonali). Questi anticorpi possono essere utilizzati
per una varietà di tecniche analitiche e preparative.
Nel Western blotting, proteine vengono prima separate da dimensione, in un gel sottile inserito
tra due lastre di vetro in una tecnica nota come SDS-PAGE (sodio dodecil solfato
poliacrilammide gel elettroforesi). Le proteine nel gel vengono poi trasferiti in un nylon PVDF,
nitrocellulosa, o membrana di sostegno. Questa membrana può essere sondato con soluzioni di
anticorpi. Gli anticorpi che si legano alla proteina di interesse possono essere visualizzati
tramite una varietà di tecniche, compresi i prodotti colorati, chemiluminescenza, o
autoradiografia. Spesso, gli anticorpi sono etichettati con un enzimi. Quando un substrato
chemiluminescente è esposto l'enzima che permette la rilevazione. Utilizzando tecniche di
western blotting permette non solo di analisi quantitativa di rilevamento, ma anche.
metodi analoghi a macchiare occidentale può essere usato per colorare direttamente specifiche
proteine in cellule vive, o sezioni di tessuto. Tuttavia, questi metodi''immunostaining'', come il
pesce, vengono usati più spesso nella ricerca di biologia delle cellule.
Eastern blotting
Eastern blotting tecnica è quella di rilevare modificazioni post-traduzionali delle proteine.
Proteine cancellati al PVDF o membrana di nitrocellulosa sono sondati per le modifiche
utilizzando substrati specifici.
Matrici
Una matrice di DNA è una raccolta di spot attaccato ad un supporto solido come un vetrino da
microscopio, dove ogni punto contiene uno o più frammenti a singolo filamento di DNA
oligonucleotide. Gli array permettono di mettere giù una grande quantità di molto piccoli
(diametro di 100 micrometri) punti in una singola diapositiva. Ogni spot ha una molecola
frammento di DNA che è complementare a una singola sequenza di DNA (simile al Southern
blotting). Una variante di questa tecnica permette l'espressione genica di un organismo in una
fase particolare di sviluppo per essere qualificato (profili di espressione). In questa tecnica
l'RNA in un tessuto è isolato e convertito in cDNA marcato. Questo DNA è quindi ibridato ai
frammenti sulla matrice e visualizzazione della ibridazione si può fare. Dal momento che array
multipli possono essere fatte con la stessa posizione dei frammenti sono particolarmente utile
per confrontare l'espressione genica di due tessuti diversi, come un tessuto sano e canceroso.
Inoltre, si può misurare ciò che i geni sono espressi e come tale espressione cambia con il
tempo o con altri fattori. Per esempio, il lievito comune, la''''Saccharomyces cerevisiae,
contiene circa 7000 geni, con un microarray, si può misurare qualitativamente come ogni gene
è espresso, e come che cambia espressione, ad esempio, con una variazione di temperatura.
Ci sono molti modi per fabbricare microarrays, le più comuni sono i chip di silicio, vetrini da
microscopio con i punti di ~ 100 micron di diametro, array custom, e gli array con le più grandi
macchie sulle membrane porose (macroarrays). Ci possono essere ovunque da 100 posti a più
di 10.000 su un dato array.
Gli array possono essere effettuati anche con altre molecole di DNA. Ad esempio, un array di
anticorpi possono essere utilizzati per determinare quali proteine o batteri sono presenti in un
campione di sangue.
Allele oligonucleotidiche specifiche
oligonucleotide specifico allele (ASO) è una tecnica che permette la rilevazione di mutazioni
singola base senza la necessità di elettroforesi PCR o gel. Breve (20-25 nucleotidi di
lunghezza), sonde marcate sono esposti al DNA bersaglio non frammentato. Ibridazione si
verifica con elevata specificità a causa della breve lunghezza delle sonde e anche un
cambiamento di una singola base ostacolerà ibridazione. Il DNA bersaglio è quindi lavato e
sonde marcate che non ibridare vengono rimossi. Il DNA bersaglio è poi analizzato per la
presenza della sonda tramite radioattività o di fluorescenza. In questo esperimento, come nella
maggior parte delle tecniche di biologia molecolare, un controllo deve essere utilizzato per
garantire la sperimentazione di successo. Illumina il test di metilazione è un esempio di un
metodo che sfrutta la tecnica di ASO per misurare differenze uno paia di basi in sequenza.
Antiquate tecnologie
In biologia molecolare, procedure e tecnologie sono in costante sviluppo delle tecnologie e
degli anziani abbandonati. Ad esempio, prima dell'avvento di elettroforesi su gel di DNA
(agarosio o poliacrilammide), le dimensioni delle molecole del DNA era tipicamente
determinato dalla velocità di sedimentazione in gradiente di saccarosio, una tecnica lenta e alta
intensità di lavoro che richiedono strumentazione costosa; prima di saccarosio gradienti,
viscometria è stato utilizzato .
A parte il loro interesse storico, spesso è utile sapere su vecchie tecnologie, come è talvolta
utile per risolvere un altro problema nuovo per il quale la tecnica più recente è inappropriato.