Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 196-199
R. Denaro, F. Crisafi, M. Yakimov, L. Genovese
Istituto per l’Ambiente Marino Costiero CNR Sezione di Messina,
Spianata S.Raineri, 86 – 98123 Messina, Italia.
[email protected]
ESPRESSIONE DEI GENI DEPUTATI ALLA VIRULENZA
IN RISPOSTA A STRESS AMBIENTALI NEL PATOGENO
LISTONELLA ANGUILLARUM
EXPRESSION OF VIRULENCE GENES IN RESPONSE
TO ENVIRONMENTAL STRESS IN THE PATHOGEN
LISTONELLA ANGUILLARUM
Abstract – Listonella anguillarum causes high mortality of fish reared in aquaculture. In this study
the expression of genes identified as responsible for virulence were observed during environmental changes
in order to better understand the mechanisms that trigger the virulence strains in the pathogen facultative
Listonella anguillarum.
Key-words: Listonella anguillarum, gene expression, virulence, environmental changes.
Introduzione – Il patogeno Listonella anguillarum viene riportato come causa di
severe infezioni che interessano per lo più pesci, bivalvi e crostacei allevati (Austin
et al., 1993; Bolinches et al., 1986; Bowser et al., 1981; Mizuki et al., 2006). Viene
considerato come un patogeno opportunista, infatti viene frequentemente determinato
insieme alla microflora del tratto intestinale degli organismi ospiti (Sugita et al., 2008),
in questa sede può rimanere innocuo oppure, in dipendenza di fattori ambientali, provocare la patologia. Tra i fattori che inducono l’insorgenza o mitigano la virulenza
di Listonella anguillarum sono stati individuati la temperatura, la salinità e la concentrazione di ferro (Crosa et al., 1980; O’Toole et al., 1996) suggerendo che il controllo
e l’ottimizzazione di tali parametri potrebbero reprimere la virulenza ed aiutare la
prevenzione delle patologie negli impianti di acquicoltura (Hauton et al., 2000; Chu et
al., 1996). È noto inoltre che la variazione di tali parametri può essere causa di stress
ed indurre stati fisiologici di quiescenza che non ne consentono la determinazione con
metodi colturali.
Gli effetti dei cambiamenti ambientali studiati mediante metodi colturali e molecolari hanno evidenziato che le variazioni di temperatura e salinità influiscono la mobilità del flagello nelle prime fasi dell’infezione, la capacità di crescita ed anche patogenicità, ma non è stata individuata fino ad oggi l’azione esercitata sull’espressione
genica del patogeno. Tale informazione consentirebbe di approfondire le conoscenze
sui meccanismi di controllo della virulenza nei ceppi patogeni opportunisti ed inoltre
potrebbe fornire importanti spunti per la scelta di markers molecolari per una rapida
diagnosi sia della presenza di Listonella anguillarum che del suo stato di virulenza.
A tal fine è stato effettuato uno studio su due sierotipi di Listonella anguillarum,
O1 (virulento, il 90% dei ceppi appartenenti a questo sierotipo ospita il plasmide PJM1
della virulenza) ed O3 (ATCC 43307 Soransen et al., 1986 carente del plasmide e considerato non virulento in seguito a test d’infezione) durante l’esposizione a variazioni
di salinità, temperatura e concentrazioni di ferro.
Sulla base della letteratura fino ad oggi riportata, i geni individuati come principali
responsabili della virulenza di Listonella anguillarum sono due plasmidici, angR e fatA
(Di Lorenzo et al., 2003) e sei cromosomici omp, rpoN, fur, empA, toxR, tonB, (Okuda
et al., 2001; Bay et al., 2007).
Il gene angR codifica per la proteina anguibactina che fa parte del sistema di tra-
Espressione dei geni deputati alla virulenza in risposta a stress ambientali nel patogeno L. anguillarum
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sporto del ferro codificato dal plasmide PJM1. Inoltre sembra che il gene angR giochi
un ruolo importante nella regolazione del gene fatA. L’anguibactina, è uno dei siderofori prodotti durante l’infezione che servono a sottrarre il ferro all’ospite e trasferirlo
ai trasportatori per consentirne l’uso al patogeno. Il gene fatA è anch’esso parte del
sistema di uptake del ferro ma la sua funzione è quella di trasporto, così come il gene
tonB (Stork et al., 2004). L’espressione del gene fatA è sottoposta ad un delicato controllo a partire dalla concentrazione stessa del ferro (Waldbeser et al., 1993), un RNA
antisense e dal gene fur in condizioni di carenza ed eccesso di ferro (Tomalsky et al.,
1994). Il gene toxR, inizialmente considerato come principale responsabile della virulenza, sembra invece essere implicato nella risposta a cambiamenti ambientali (Okuda
et al., 2001). Il gene omp codifica per proteine dette porine e sembra avere una funzione nella resistenza dei microrganismi a sostanze dannose, garantisce per esempio la
resistenza alla bile (Wang et al., 2003). Il gene empA codifica per metalloproteasi che
prendono parte al processo di infezione espletando attività proteolitica durante la fase
dell’invasione (Denkin et al., 2004). Il gene rpoN fa parte dei sigma factors e sembra
essere espresso in maniera costitutiva per questo motivo viene considerato gene housekeeping (Gonzalez et al., 2003).
Materiali e metodi – Sono state allestite colture di Listonella anguillarum sierotipi
O1 ed O3, che venivano coltivati in condizioni ottimali (25 °C, 1% NaCl, 50 µM) in
tre diverse condizioni di salinità (contenuto in NaCl 1.5-3-5%), temperatura (15-25-37
°C) e concentrazione di ferro (minima per aggiunta di EDTA, 5 µM ferro cloruro e
10 µM ferro cloruro). Con l’intento di quantificare la reale attività dei geni le analisi
sono state effettuate su RNA. Le colture venivano monitorate mediante lettura fotometrica OD600nm ed i campioni per l’estrazione dell’RNA venivano raccolti in triplo
durante la fase esponenziale. Un totale di 27 campioni veniva raccolto per ogni sierotipo. La misura dell’espressione genica avveniva mediante analisi quantitativa relativa
in real time pcr, utilizzando come housekeeping il gene rpoN. L’elaborazione dei dati
è avvenuta mediante il metodo DDCt che prevedeva la normalizzazione dei risultati
sia in relazione al gene di riferimento che alle condizioni ottimali di crescita rispetto
alle condizioni di stress. La chimica usata, metodo Syber Green ha previsto delle fasi
preliminari di ottimizzazione delle condizioni di reazione.
Il disegno sperimentale della reazione di real time PCR prevedeva:
-- La valutazione del gene housekeeping come affidabile riferimento per il metodo
analitico testato (DDCt). A tal fine sono state effettuate diluizioni seriali del
cDNA alle condizioni ottimali di crescita, ciascuna diluizione diveniva templato per testare tutti i geni target. Viene considerato positivo il test in cui i
geni target danno la stessa efficienza di amplificazione del gene housekeeping.
-- La verifica della specificità dei primers: amplicone unico, assenza di dimeri,
specificità di sequenza.
-- Ottimizzazione della concentrazione dei primers
-- Real time pcr
-- Elaborazione dei risultati: il valore del ciclo soglia di amplificazione del gene
target veniva normalizzato rispetto a quello dell’housekeeping ed il risultato
veniva normalizzato rispetto al calibratore che nel nostro caso era costituito
dalle condizioni ottimali di crescita dei due ceppi.
Risultati – Il sierotipo O1 di Listonella anguilarum, ceppo virulento ha mostrato il
seguente comportamento:
alla temperatura di 15 °C è stata registrata una overespressione dei geni toxR ed
empA rispettivamente del 20% e del 50% rispetto al gene costitutivo rpoN.
Alla temperatura di 37 °C vengono overespressi i geni plasmidici (angR del 40% e
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R. Denaro, F. Crisafi, M. Yakimov, L. Genovese
fatA del 30% rispetto al gene housekeeping) e tutti gli altri geni uniformano il trend
di espressione a quella dell’housekeeping.
L’aggiunta del 3% di salinità al terreno stimola l’espressione di toxR, angR e fatA
con una quantità tre volte superiore rispetto all’espressione basale. L’aumento della
salinità fino al 5% favorisce l’espressione di empA ed angR ed in minima parte toxR,
mentre reprime omp, fur, tonB e fatA per circa il 20% rispetto all’housekeeping. La
carenza di ferro ottenuta mediante l’aggiunta di EDTA determina un’overespressione
dei geni plasmidici deputati alla cattura e trasporto del ferro, mentre l’aggiunta di
quantità crescenti di ferro determina l’aumento dell’espressione del gene toxR in un
modo dose–dipendente. Il sierotipo O3 ha mostrato un comportamento differente, già
visibile dal trend delle curve di crescita del ceppo esposto a variazioni ambientali.
Infatti mostrava curve di crescita più basse e sembrava rispondere meno prontamente
alle variazioni ambientali. Alla temperatura di 15 °C toxR, tonB e fur venivano overespressi a 37 °C fur, tonB ed empA con una massima espressione di fur. L’aumento
di salinità sia al 3% che al 5% causava elevatissime espressioni di tutti i geni ed in
particolare fur che raggiungeva valori fino a 12 volte superiori rispetto al gene di riferimento. L’aggiunta di EDTA stimolava l’espressione di tonB, in condizioni di carenza
di ferro, mentre l’aggiunta di 5 e 10 µM di ferro reprimeva l’espressione di tonB e
stimolava prevalentemente l’espressione di fur e toxR. Dal confronto tra i due sierotipi
emerge una differente risposta alle variazioni ambientali con una migliore capacità
di reazione allo stress del sierotipo O1 rispetto al sierotipo O3. Data l’assenza del
plasmide nel sierotipo O3, l’espressione dei geni deputati alla virulenza non è sovrapponibile eccetto che per alcuni di essi. toxR e tonB sembrano essere i geni che in
entrambi i ceppi rispondono alle variazioni di temperatura, salinità e carenza di ferro.
Una espressione differenziale è stata registrata per i geni plasmidici nel sierotipo O1
che rispondono prontamente con elevati picchi di espressione in condizioni di carenza.
Le stesse condizioni inducono un aumento nell’espressione dei geni toxR ed omp. Il
sierotipo O3 risponde con toxR e fur ma in un modo che non è dose-dipendente così
come viene registrato per il sierotipo O1.
Conclusioni - In conclusione lo stress che maggiormente causa una espressione
differenziale è la carenza di ferro che porta all’aumento dell’espressione dei geni coinvolti nella produzione di siderofori, che in vivo sono deputati alla cattura e trasporto
del ferro causando emorragia nei tessuti infetti. Inoltre il gene fur, che fino ad oggi
veniva indicato come responsabile della virulenza (Tomalsky et al., 1994) regolando
l’espressione dei geni plasmidici, sembra avere un ruolo preponderante nel sierotipo O
3 che manca del plasmide, nella risposta alle variazioni ambientali.
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