ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO

(Reazione a catena della polimerasi)
&
ESTRAZIONE del DNA da gel
di AGAROSIO
Corso di
Ingegneria Genetica e Microbiologa Applicata
Prof. Renato Fani
Percorso1:
Analisi della variabilità genetica di popolazioni
microbiche elettrigeniche
L’identificazione dei
microrganismi avviene
attraverso l’ANALISI del
16S rDNA
GGCTGAGATGGCTAGCTGGTCTGAGAGGATGGCCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA
CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGTGATGA
AGGCCTTCGGGTCGTAAAGCCCTGTCAAGAGGGACGAAACCTCGTCGACCTAACACGTCGACGACCTGAC
GGTACCTCTGAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTG
TTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGTGTAGGCGGCCTTCTAAGTCTGGTGTGAAAGCCCGGGGCTCAAC
CCCGGAAGTGCATTGGATACTGGGAGGCTGGAGTACCGGAGAGGAGGGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTG
AAATGCGTAGATATCAGGAGGAACACCGGTAGCGAAGGCGGCCCTCTGGACGGATACTGACGCTGAGACG
CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGGCACTAGGTGT
TCGGGGTATTGACCCCCTGAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAATACGGCCGCAAG
GTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGC
GAAGAACCTTACCTGGGCTAGACAACATCGGACAGCCCCAGAAATGGGGTCTCCCCGCAAGGGGCCGGTG
GTTCAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
Spirochete
Deinococci
Verdi non zolfo-ox
Verdi
zolfo-ox
Bacteroidi
Planctomyces
Chlamidie
Gram+
Thermotoga
Aquifex
Hydrogenobacter
Cianobatteri
Proteobatteri
E. coli
S. flexneri
S. typhimurium
S. enterica
Y. pestis
B. aphidicola
B.floridanus
S. oneidensis
V. cholerae
V. parahaemolyticus
V. vulnificus
P. multocida
H. influenzae
P. aeruginosa
P. putida
P. syringae
X. fastidiosa
X. campestris
X. axonopodis
N. europaea
C. violaceum
N. meningitidis
R. solanacearum
B. pertussis
B. parapertussis
B. bronchiseptica
C. crescentus
B.japonicum
S. meliloti
A. tumefaciens
M. loti
B. melitensis
B. suis
H. hepaticus
W. succinogenes
C. jejuni
0.05
Albero filogenetico dei proteobatteri
DETERMINAZIONE ed ANALISI
DELLA SEQUENZA
NUCLEOTIDICA
DETERMINAZIONE DELLA
SEQUENZA NUCLEOTIDICA
DEL 16S rDNA
Costruzione
albero
filogenetico
Allineamento
delle
sequenze
(MEGA)
(ClustalW)
CONFRONTO IN BANCA
DATI DELLE SEQUENZE
OTTENUTE
(BLASTn)
Come si ottiene il 16S
rDNA da una colonia
batterica?
AMPLIFICAZIONE DEL 16S rDNA
LISI TERMICA
16S rDNA
MILIARDI DI COPIE
DEL 16S rDNA
AMPLIFICAZIONE DEL 16S rDNA
LISI TERMICA
16S rDNA
ELETTROFORESI SU GEL
DI AGAROSIO
MILIARDI DI COPIE
DEL 16S rDNA
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica
che ha rivoluzionato il mondo della chimica e della
genetica,
permettendo l’amplificazione in vitro di frammenti di
DNA con innumerevoli applicazioni in campo medico,
agrario, animale e nelle investigazioni della magistratura.
  DNA polimerasi termoresistenti e optimum di T≥70°C
  Oligonucleotidi che fungono da innesco
 18-20 nt e 50-60% GC
  dNTP
  DNA stampo
  Mg2+
Non è indispensabile conoscere
la sequenza intera
PERCHE’ ?
Basta conoscere le estremità del frammento di DNA da
amplificare
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
Disegnare oligonucleotidi (frammenti
di DNA) a singola elica
complementari ad una delle due
estremità
GATTCC
TTCGGG
AAGCCC
CTAAGG
TTCGGG
GATTCC
PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO
DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO
VIENE DENATURATO
2-APPAIAMENTO: TEMP. 50-65°C . I PRIMER SI
APPAIANO CON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL
FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus)
POLIMERASI
Denaturazione del DNA
GATTCC
AAGCCC
CTAAGG
TTCGGG
Rinaturazione del DNA
GATTCC
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
TTCGGG
Estensione Taq POLIMERASI
72°C
Estensione Taq POLIMERASI
72°C
GATTCC
CTAAGG
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
AAGCCC
TTCGGG
Denaturazione
Estensione Taq POLIMERASI
72°C
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
GATTCC
CTAAGG
AAGCCC
TTCGGG
DNA
stampo
5’
3’
3’
5’
Primer
94-95°C
per
30-60’’
55-72°C
(5°C < Tm primer)
72°C
Nella provetta è
presente una sola
copia del gene X
Nella provetta sono
adesso presenti
miliardi di copie del
gene X
gene X
gene X
Nella provetta non
è presente il gene
X
Nella provetta non è
presente il gene X
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
Controllo negativo
Marker
AMPLIFICAZIONE DEL 16S rDNA
LISI TERMICA
16S rDNA
ELETTROFORESI SU GEL
DI AGAROSIO
MILIARDI DI COPIE
DEL 16S rDNA
Preparazione Reazione di Sequenziamento
Lisi termica
La lisi cellulare corrisponde alla rottura degli involucri cellulari (parete e
membrana) con conseguente fuoriuscita delle componenti cellulari, tra cui il
DNA da cui faremo in seguito l’amplificazione via PCR del gene 16S
rDNA.
Protocollo sperimentale
1. Prelevare con la punta di una micropipetta una singola colonia (da piastra di LB
del 20/4) del diametro di ca. 1mm2 e stemperarla in 20 µl di H2O bidistillata
sterile, in un tubo eppendorf.
3. Incubare per 10’ a 95°C e per almeno 5’ in ghiaccio per operare la lisi delle
cellule.
5. Il campione viene poi brevemente centrifugato per separare fase solida da
fase acquosa dove è solubilizzato il DNA.
LISI TERMICA
10 min a 95 °C e 5 min
in ghiaccio
TIPICA MISCELA DI REAZIONE
COMPONENTE
VOLUME
H2O (a 20µl di volume finale)
10 X PCR Buffer
MgCl2
Forward primer P0
(20 pmols/µl)
Reverse primer P6
(20 pmols/µl)
10 X dNTPs (2mM)
polimerasi termostabile (5U/µl)
12 µl
Concentrazione
finale
Marker
(µl)
Sample
(µl)
DNA
1
18
BBF
1(6X)
2(10X)
TE
4
-
ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO
Procedura:
· Pesare un tubo eppendorf vuoto e segnare il risultato.
· Tagliare con un bisturi il frammento di DNA che interessa dal gel d’agarosio.
Durante questa fase è opportuno tagliare quanto più vicino al frammento in modo
tale da prelevare la minima quantità di gel insieme al DNA di
interesse.
· Porre la fetta di gel nel tubo eppendorf precedentemente pesato e pesare
nuovamente il tutto. Segnare il risultato e calcolare il peso della fetta.
Campione
Peso
eppendorf
Peso ep
p+fetta
Peso della
fetta
V QG
DNA [ng/µl]
Procedura:
· Aggiungere 3 volumi del buffer QG ad 1 volume di gel (100 mg ≈ 100 µl).
Es: aggiungere 300 µl di buffer QG per un frammento di 100 mg. IL Buffer
QG contiene delle sostanze capaci di sciogliere l’agarosio permettendo così la
liberazione del DNA dalle maglie del gel stesso.
· Incubare per 10 minuti a 50°C. I tempi di incubazione possono essere
aumentati per la completa dissoluzione del gel; per facilitare lo scioglimento
vortexare, ogni 3 minuti, il tubo eppendorf (3-4 volte).
· Trasferire la soluzione nella colonnina fornita dal Kit; essa contiene una
membrana che ha grande affinità per il DNA.
· Centrifugare per 1 minuto a 13000 rpm; in questo modo, durante la
centrifugazione, il DNA si lega alla membrana della colonnina, mentre il resto
attaversa la colonnina e si deposita sul fondo del tubo di plastica.
· Eliminare quindi l’eluato e riporre la colonnina nel tubo di plastica.
Procedura:
· Aggiungere 750 µl del buffer PE. Incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente.
Questo passaggio serve essenzialmente ad operare un lavaggio della colonnina
permettendo l’eliminazione delle scorie residue e lasciando il DNA adeso alla
membrana della colonnina stessa.
· Centifugare per 1 minuto a 13000 rpm.
· Eliminare quindi l’eluato e riporre la colonnina nel tubo di plastica.
· Centrifugare ancora una volta per 1 minuto a 13000 rpm. Questo passaggio permette
di eliminare tutti i residui di etanolo.
· Eliminare l’eluato e porre la colonnina in un tubo eppendorf da 1.5 ml.
· Aggiungere 10 µl del buffer EB (Tris-HCl 10 mM pH 8.5) al centro della membrana.
Fare attenzione a non toccare la membrana con la punta. Il tampone EB permette di
“staccare” il DNA dalla colonnina.
· Centrifugare 1 minuto a 13000 rpm.
· L’eluato presente nell’eppendorf contiene il DNA e va quindi conservato
I prodotti di amplificazione purificati sono visualizzati e quantificati
successivamente mediante elettroforesi su gel di agarosio.
Marker Sample
(µl)
(µl)
DNA
1
9
BBF
1(6X)
1(10X)
TE
4
-
1500 bp
Marker Sample
(µl)
(µl)
DNA
1
1
BBF
(6X)
1
1
TE
4
4
60 ng
/µl
Preparazione dei campioni per la reazione di sequenziamento
Si richiede la preparazione di una miscela con un volume finale pari a 11
µl in cui vi deve essere una quantità di DNA di cui si vuole ottenere la
sequenza nucleotidica pari a 10 ng ogni 100 bp.
Il nostro frammento è lungo 1500 bp quindi una quantità totale di 150 ng,
se per esempio il nostro campione precedentemente purificato era
stato quantificato 50 ng/ µl, avremo bisogno di un volume di 3 µl.
Occorre inoltre 1 µl di primer Po alla conc. di 3,2 µM.
Dunque in questo particolare esempio, 3 µl di DNA purificato + 1 µl di
primer Po + 7 µl di dH2O per portare a volume.
DNA
purificato
Vfin = 11µl
10 ng ogni
100 bp
P0
(conc. 3,2 µM)
1 µl
dH2O
Per portare
a volume