Elettrofisiologia
APPLICAZIONI
studio delle proprietà
elettriche delle cellule
eccitabili
neuroni, muscolo striato e cardiaco
POTENZIALE DI MEMBRANA
tutte le cellule hanno un potenziale di
membrana
il potenziale è mantenuto
elettrochimici di equilibrio
da
gradienti
il potenziale di membrana è soggetto a
variazioni dovute ai potenziali d’azione e alle
attività sinaptiche afferenti
equazione di Nernst:
equazione di Goldman:
EK = potenziale equilibrio K+, R = costante dei gas; T = temperatura Kelvin;
z = valenza del potassio, F = costante di Faraday
capacitanza: mantenere una carica
batteria: forza
elettromotorice
resisitenza:
permeabilità ionica
nei neuroni il potenziale di equilibrio è più prossimo a quello del K+ che non a
quello del Na+
POTENZIALI SINAPTICI E DI AZIONE
POTENZIALI SINAPTICI E DI AZIONE
EPSP
sposta il potenziale di membrana verso valori positivi
(in genere aumenta [Na+]i)
IPSP
sposta il potenziale di membrana verso valori negativi
(in genere aumenta [Cl-]i)
EPSP
genera i potenziali d’azione (nelle cellule eccitabili)
Il potenziale d’azione differisce dai potenziali di membrana perché
dipende necessariamente dall’apertura di specifici canali ionici
voltaggio-sensibili, che data la loro cinetica rapida, consentono di
veicolare il segnale mediante treni di potenziali d’azione
ELETTRODI PER ELETTROFISIOLOGIA
dimensioni e caratteristiche dell’elettrodo variano a seconda della particolare
applicazione
AMPLIFICAZIONE E FILTARAGGIO
DEL SEGNALE
amplificare (fattore variabile) il segnale e
trasmetterlo per l’archiviazione
PREAMPLIFICATORI
misurare i piccoli voltaggi di un neurone
lasciandoli inalterati
FILTRI A BANDA PASSANTE
eliminano componenti ad alta
frequenza (onde radio) e a bassa
frequenza (pulsazioni)
SOMMAZIONE DELLE REGISTRAZIONI
SCELTA DEL PREPARATO
le proprietà delle membrane
neuronali sono simili nelle varie
specie animali, perciò esiste una
ampia varietà di scelta dei
preparati su cui effettuare gli studi
di elettrofisiologia
PREPARATO ACUTO in vivo
VANTAGGI
- mantenimento rapporti sinaptici
- ambiente extracellulare
- ossigenazione e nutrimento
- chiara identificazione cellulare
PUNTI DEBOLI
- anestesia
- ambiente extracellulare da manipolare
- riproducibilità limitata
- difficile fare valutazioni intracellulari
Aplysia californica
PREPARATO CRONICO in vivo
VANTAGGI
- assenza di anestetici
- mantenimento di riflessi e comportamento
- possibilità di addestrare l’animale
- possibilità di ottenere molti dati da un animale
PUNTI DEBOLI
- mancanza di individuazione precisa sui neuroni
- influenza dello stato comportamentale
- spostamento degli elettrodi
PREPARATO in vitro
fettine di tessuto cerebrale
colture cellulari
midollo spinale di rana o di ratto
VANTAGGI
-facilità di registrazione e identificazione dei
neuroni
-regolazione dell’ambiente extracellulare
PUNTI DEBOLI
- si possono evidenziare effetti non manifestati da
preparati in vivo
IDENTIFICAZIONE DI CELLULE
localizzazione anatomia
connettività
tipo di attività
morfologia
potenziali antidromici
tonica vs fasica
coloranti
IDENTIFICAZIONE DI CELLULE
IDENTIFICAZIONE DI CELLULE
LIVELLI DI ANALISI
-gruppi di neuroni
-neuroni singoli
-membrana
TIPI DI REGISTRAZIONE
-intracellulare
-extracellulare
REGISTRAZIONI EXTRACELLULARI
-registrano i campi elettrici intorno alla cellula
-possono evidenziare la partecipazione di una
cellula a un circuito nervoso
-possono evidenziare risposte farmacologiche
- non evidenziano meccanismi, e non rilevano
eventi che non diano luogo a potenziali di azione
REGISTRAZIONI INTRACELLULARI
-molto più difficoltose delle registrazioni
extracellulari, ma decisamente più accurate
-registrano il potenziale di riposo e la resistenza
della membrana
-registrano tutti gli eventi elettrici, anche quelli
non associati a potenziali di azione
- registrano solo i corpi, ma non assoni e dendriti
PROCEDURA PRATICA PER LE
REGISTRAZIONI INTRACELLUALARI
Registrazione intracellulare: gli elettrodi sono costituiti da
pipette di vetro riempite con una soluzione salina
concentrata e poste sui due lati della membrana. Fili
metallici inseriti nell’estremità posteriore delle pipette
vengono connessi attraverso un oscilloscopio che
visualizza direttamente sullo schermo l’ampiezza del
potenziale di membrana in volt.
Quando entrambi gli elettrodi sono fuori dalla cellula non si
registra alcuna differenza di potenziale. Tuttavia, non appena
uno degli elettrodi penetra all’interno della cellula,
sull’oscilloscopio compare una deflessione stabile che
rappresenta il potenziale di membrana di riposo. Nella maggior
parte delle cellule nervose a riposo il potenziale di membrana è
all’incirca –70 mV.
Vm
( mV)
+60
Inserzione dell’elettrodo
+30
0
-30
-60
Potenziale di riposo
-90
Tempo
Impulsi depolarizzanti di corrente di debole intensità (ottenuti rendendo
positivo l’elettrodo intracellulare) danno origine a semplici potenziali
elettrotonici (passivi) nei quali le variazioni dell’ampiezza del potenziale sono
sempre proporzionali all’ampiezza degli impulsi della corrente stessa.
Tuttavia, le correnti depolarizzanti tendono a sospingere il potenziale di
membrana verso un livello critico, detto soglia, al quale si innesca una
risposta attiva, che consiste nell’apertura dei canali voltaggio-dipendenti.
L’apertura di questi canali dà origine ad un potenziale d’azione che differisce
dai potenziali elettrotonici non solo per il modo in cui prende origine ma anche
per ampiezza e durata.
Se si inverte il senso in cui scorre la corrente, rendendo
negativo l’elettrodo intracellulare rispetto a quello extracellulare,
il potenziale di membrana diviene più negativo. Questo aumento
del numero di cariche viene detto iperpolarizzazione
TECNICHE DI VOLTAGE CLAMP
E PATCH CLAMP PER VALUTARE
GLI EVENTI DI MEMBRANA
VOLTAGE CLAMP
-permette di studiare le correnti ioniche indotte che si
verificano in una membrana mantenuta sotto una differenza
di potenziale che viene variata gradualmente dall’operatore
-registra le correnti in forma cumulativa
PATCH CLAMP
-permette di studiare le correnti ioniche per un singolo
canale specifico
-variando differenza di potenziale della membrana,
composizione del liquido nell’elettrodo, concentrazione
dei trasmettitori si possono valutare tutti i parametri che
regolano lo stato di apertura del canale e le cinetiche
del processo
-ha sostituito quasi del tutto il voltage clamp
vantaggi: permettono studi accurati sulle
membrane
svantaggi: si perde il contenuto cellulare
interno
Registrazione della
corrente di un singolo
canale ionico quando il
canale passa dallo stato
chiuso a quello aperto
Applicazioni umane
Analisi del tracciato EEG
• Ampiezza
• Frequenza (attività delta <4Hz, teta 4-8
Hz, alfa 8-13 Hz, beta>13Hz)
• Periodicità (punte e onde)
• Distribuzione spaziale (grado di
diffusione)
Deep brain stimulation
