SICUREZZA ALIMENTARE: PROBLEMI EMERGENTI
BOLOGNA 22 giugno 2009
PERICOLI MICROBIOLOGICI
EMERGENTI
Nuovi approcci analitici
Leonarda Chetti - Arpa Sezione di Bologna
Principali agenti eziologici
BATTERI
• Campylobacter spp.
• Salmonella spp.
• Listeria monocytogenes
• E. coli VTEC
• E. sakazakii
• Clostridium spp.
• Staphilococcus aureus
• Bacillus cereus
• Vibrio spp.
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Principali agenti eziologici
VIRUS
• Norovirus o Norwalk-like
viruses
• Epatite A
• Epatite E
• Rotavirus
PARASSITI
TOSSINE
ALTRI AGENTI
Prioni (BSE)
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CAMBIAMENTI
Hazards
• E. coli VTEC
• Enterobacter sakazakii
• Norovirus, HAV
• Cyclospora cayatenensis, Criytosporidium
• Salmonella Spp. (S. Stanley, S. Mbandaka, S.
Weltevreden)
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Patogeni emergenti
Norovirus
Rotavirus
L. pneumophila
E. sakazakii
Staph. enterotossico
E. Coli O157:H7
V. Cholerae 0139
Cryptosporidium
1972
1973
1977
1980
1981
1982
1992
1994
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Tossinfezioni alimentari
Patogeno
Anno
Luogo
Veicolo
E. Coli O157:H7
U.S.A.
Succo di mela
E. Coli O157:H7
1991,1996,
1999
1997, 1997
U.S.A
Semi germogliati
Norovirus
1997
U.S.A.
Fragole
Norovirus
2001
Svezia
Lamponi congelati
Norovirus
2006
Svezia,
Olanda
Lamponi congelati
E. Coli O157:H7
2006
U.S.A.
Salmonella
2007
Norvegia,
Danimarca,
Svezia
Spinaci crudi
Germogli αα
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CAMBIAMENTI
Veicoli alimentari
(Da: Microbiological hazards, FAO-WHO 2008)
• Fresh fruits and vegetables
• Leafy green vegetables (spinach, lettuce and salade leaves)
• Berries (raspberries, blackberries, strawberries, blueberries)
• Sprouted seeds, Carrots, Cucumber
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METODI ANALITICI
PATOGENI EMERGENTI
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METODI ANALITICI
Staphylococcus aureus in alimenti
• UNI EN ISO 6888-1:2004
Enterotossina in alimenti e tamponi
(ambientali, clinici)
• Metodo di agglutinazione inversa passiva al lattice
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Laboratorio Microbiologia
Arpa Bologna
CAUSA
EFFETTO
Sorgente di infezione
Veicoli di infezione
Operatori del
Laboratorio di produzione
Prodotti di pasticceria
Paste fresche
ENTEROTOSSINA STAFILOCOCCICA
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E. Coli O157
Metodi di tipizzazione fenotipica
METODO COLTURALE ISO 16654
• Arricchimento: mTSB+N (T=41.5 °C ± 1°°C t=6h / t=18h)
• Separazione e concentrazione con biglie immunomagnetiche
ricoperte di anticorpi anti-E.coli O157
• Isolamento in CT-SMAC e un secondo terreno (a scelta)
• Conferma biochimica e agglutinazione con siero anti-E. coli
O157
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E. Coli O157
DIAGNOSI MOLECOLARE
• Identificazione di E. coli O157:H7 mediante
multiplex-PCR
• Identificazione di tutti gli EHEC enteroemmorragici
(gene eae per intimina) mediante Real-time PCR
• Identificazione di tutti gli STEC/VTEC produttori di
tossine shiga-like (geni stx1 e stx2 ) mediante Real-time PCR
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Pericolo emergente nei prodotti
alimentari per neonati:
Enterobacter sakazakii
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Enterobacter sakazakii
• Bacillo gram –
• Famiglia Enterobacteriaceae
• Genere Enterobacter
• 15 biogruppi
• Asporigeno, mesofilo
• Patogeno opportunista
Solo nel 1980 riconosciuto come specie distinta da
Enterobacter cloacae
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Enterobacter sakazakii
PATOLOGIE GRAVI
SOGGETTI A RISCHIO
• Meningiti
• Batteriemie
• Enterocoliti
necrotizzanti
• Esiti letali
•
•
•
•
•
Neonati
Nati pre-termine
A basso peso
Immunocompromessi
Sotto terapia intensiva
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Enterobacter sakazakii
HABITAT
• Alimenti (formaggi, tofu, carne macinata, carne affumicata,
salsiccia, riso, the, cereali, cioccolato, farina, pasta)
• Ambiente (suolo, acqua)
• Animali (ratti, mosche)
• Liquidi biologici
• Ambiente ospedaliero (stetoscopio, spazzolini per
biberon)
Riserva ambientale: intestino larve mosca Stomoxys calcitrans
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Enterobacter sakazakii
VEICOLO ALIMENTARE
LATTE FORMULATO IN POLVERE PER L’INFANZIA
a base di latte vaccino o di soia
DOSE INFETTANTE
Valore stimato: circa 1000 cellule
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Enterobacter sakazakii
REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 e n. 1441/2007
CRITERI MICROBIOLOGICI
Alimenti in polvere per lattanti e alimenti dietetici in polvere
a fini medici speciali destinati a bambini di età inferiore a
sei mesi
Piano campionamento: n=30, c=0
Limiti: Assente in 10 g
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Enterobacter sakazakii
METODI ANALITICI
Metodi di tipizzazione fenotipica e biochimica
- ISO/TS 22964:2006(E)
- MPN a 3 tubi (FDA)
Metodi di tipizzazione molecolare
- PCR Real-time
- (RAPD, PFGE) degli isolati, per scopi epidemiologici
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Enterobacter sakazakii
REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 e n. 1441/2007
METODO ANALITICO:
ISO/TS 22964:2006(E)
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Enterobacter sakazakii
MISURE PREVENTIVE
INDUSTRIA ALIMENTARE
AMBIENTE OSPEDALIERO
ASILI NIDO
AMBIENTE DOMESTICO
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Enterobacter sakazakii
Raccomandazioni FDA
GHP (Good Handling Practices)
Piano di autocontrollo HACCP
UNITÀ DI TERAPIA INTENSIVA NEONATALI
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Enterobacter sakazakii
The American Dietetic Association
GUIDELINES
for infant formula preparation, storage and administration
Hospitals
Private home
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Enterobacter sakazakii
Industria alimentare
Monitoraggio materie prime
Idonei piani di sanificazione
Controlli microbiologici ambientali e sul prodotto
Revisione etichetta del prodotto:
- formulazione di corrette istruzioni di ricostituzione e
preparazione del prodotto;
- comunicazione del rischio al consumatore
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PERICOLI MIROBIOLOGICI EMERGENTI
VIRUS ENTERICI
NOROVIRUS
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NOROVIRUS
1972: isolato a Norwalk - Ohio (da feci di paziente in
epidemia gastroenterica)
Agente etiologico dell’ 85% delle gastroenteriti
epidemiche non batteriche
In U.S.A. la maggior causa di gastroenteriti alimentari
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NOROVIRUS
Dati Epidemiologici
TREND ASCENDENTE
di episodi di gastroenteriti dovuti a consumo di alimenti
contaminati da Norovirus, sia in Europa (notifiche RASFF)
che in U.S.A.
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NOROVIRUS
Famiglia: CALICIVIRIDAE
Genere: NOROVIRUS
Dimensioni: 30-35 nm
Genoma: RNA – singolo filamento
Capside: 1 proteina strutturale
5 genogruppi: GI e GII infettano l’uomo
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NOROVIRUS
Colpiscono soggetti di tutte le età
Ospedali, scuole, ristoranti, navi da
crociera, centri turistici
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INFEZIONE DA NOROVIRUS
Sintomi: Vomito, diarrea, crampi addominali, febbre
Tempo di incubazione: 24 - 48 ore
Durata malattia: 1-2 giorni
Non conferiscono immunità persistente (pochi mesi e specifica)
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VIRUS ENTERICI PATOGENI
Ospiti naturali
Uomo
Animali
Norovirus
si
no (?)
HAV
si
no
Astrovirus
Rotavirus
si
si
no
alcuni ceppi
Poliovirus
si
no
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INFEZIONE DA NOROVIRUS
Sorgente: l’uomo
Escrezione con feci e vomito (da 15 ore dopo l’esposizione e
fin oltre 14 gg.
Portatori asintomatici (oltre 1 anno)
Prevalenza durante i mesi freddi
Percentuale di attacco tra gli esposti fino all’ 83%
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NOROVIRUS
TRASMISSIONE ORO-FECALE
Mediante:
Alimenti (molluschi bivalvi, frutta e vegetali crudi)
Contagio interumano
Acqua (irrigazione/lavaggio)
Superfici/oggetti contaminati
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NOROVIRUS
Dose infettante :
< 10/10 2 cellule
Eliminate:
10 8 particelle virali/g di feci
10 7/10 8 particelle virali in vomito e aerosol
Elevata resistenza ambientale (Tempo di sopravvivenza
su superfici : > 12 gg)
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NOROVIRUS
Sopravvivenza ai trattamenti:
• Congelamento: mesi (mitili per 15 settimane,
lamponi per 1 anno)
• Cottura (> 60 ° C per 30’, azione protettiva di grassi/proteine)
• Lavaggio dei vegetali
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NOROVIRUS
Misure preventive
• In campo (smaltimento liquami, acqua irrigazione)
• Educazione operatori (Buone pratiche igieniche,
igiene personale, sanificazione)
• Procedure di lavaggio/disinfezione prodotti da
consumare crudi
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NOROVIRUS
REGOLAMENTO 2073/2005
stabilisce alcuni criteri di sicurezza nei prodotti
vegetali
Non definisce limiti per virus enterici
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NOROVIRUS
Difficoltà diagnostiche
• Non rilevabili con metodi colturali (colture cellulari)
• eterogeneità genetica dei ceppi
• mancanza di metodi standardizzati e validati
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Virologia clinica
Elevate concentrazioni
Virus umani
Presenza in genere di una sola specie
Costanza nella composizione dei campioni
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Virologia ambientale
Basse concentrazioni (incapacità di
moltiplicarsi nell’ambiente)
Molteplicità di specie e variabilità genetica
(Numerosi ceppi)
Presenza di contaminazioni multiple
Eterogeneità di composizione dei campioni
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Virologia ambientale
1960-1980
Tecniche di isolamento
colture cellulari
coltivabilità dei virus
Dal 1985
Sviluppo di tecniche biomolecolari
virus non coltivabili
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ricerca di
NOROVIRUS
Diagnostica molecolare
RT – Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Identificazione del patogeno in campioni biologici e in
matrici alimentari
• Sequenziamento per verifica epidemiologica tra ceppi umani
e ambientali isolati
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Metodi biomolecolari
Elevato costo
Non dimostrano l’infettività
Presenza di inibitori
Alta specializzazione del personale
Mancanza di metodi standardizzati
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Norme ISO
Microbiology of food & animal feeding stuffs- Polymerase Chain Reaction
(PCR) for the detection of food-borne pathogens:
• UNI EN ISO 22174:2005 Requisiti generali e definizioni
• ISO/TS 20836:2005 Performance testing for thermal cyclers
• ISO 20837:2006 Requirements for sample praparation for
qualitative detection
• ISO 20838:2006 Requirements for amplification and detection
for qualitative methods
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