Il controllo della fertilizzazione e la qualita

LABORATORIO DI BIOLOGIA DELLA
RIPRODUZIONE
Il controllo della fertilizzazione e la qualità
embrionaria
AM 2004
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FECONDAZIONE
processo che porta alla fusione del patrimonio genetico
materno e di quello paterno con la formazione di un
nuovo individuo
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La normale fecondazione
avviene secondo una serie di
eventi che si svolgono in tempi
differenti per ogni ovocita.
Payne et al., 1997
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Eventi nel processo di
fecondazione::
fecondazione
aumento intracellulare del calcio
esocitosi dei granuli corticali
modificazione della ZP e blocco
alla polispermia
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Fattori coinvolgenti l’esito delle tecniche di fecondazione
assistita
Stimolazione
ovarica
Manipolazione
Infertilità
Condizioni di
coltura
Transfer
Classificazione
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L’osservazione viene eseguita all’invertoscopio
dopo 16-18 ore dall’inseminazione
CRITERI
PRATICI
Si valuta sia la presenza dei 2PN ravvicinati al
centro dell’ovocita con la configurazione dei
nucleoli in num. ridotto e la presenza dei 2 PB;
Per la FIVET si esegue prima la rimozione
meccanica del cumulo ooforo e della corona
radiata;
Per l’ICSI: osservazione diretta
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Valutazione nella coltura in vitro
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Valutazione della qualità dello zigote
Tesarik & Greco,1999
Scott & al, 2000
Timing: 16 - 18 ore postpostinseminazione
Parametri:
- disposizione PN e
nucleoli
- aspetto citoplasma “Halo
- timing breakdown
membrana dei PN (24(24-26 h)
NUCLEOLI
Timing:: 12 - 20 ore postTiming
postinseminazione
Parametri::
Parametri
- numero di nucleoli
- disposizione dei
nucleoli
L’ asincronia nella formazione e nella polarizzazione può
severamente compromettere lo sviluppo dell’ embrione e il
suo impianto
impianto..
Van Blerkom , 1990; Tesarik and Greco, 1999; Scottet al., 2000
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Tesarik e Greco, 1999
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P
r
o
S
2 PN
n
0 PN
t
u
a
c
d
l
i
3 PN
e
> PN
o
a
r
e
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FERTILIZZAZIONE ANOMALA
Presenza di un pronucleo (1pn):
Rappresenta circa l’1% degli ovociti fertilizzati in vitro;
Può risultare da un’attivazione partenogenetica
dell’ovocita
Può risultare da un’asincronia nella formazione dei
pronuclei;
Può risultare da una singamia precoce
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FERTILIZZAZIONE ANOMALA
Presenza di tre pronuclei:
Rappresenta circa il 5% degli ovociti fertilizzati
in vitro;
Può derivare dalla fertilizzazione di un’ovocita
con uno spermatozoo diploide;
Può derivare dalla fertilizzazione di un’ovocita
con due spermatozoi.
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FERTILIZZAZIONE ANOMALA
Arresto del clivaggio allo stato di zigote
dovuto ad un fallimento nell’attivazione
ovocitaria;
dovuto a difetti nella struttura ovocitaria;
dovuto a incorretta localizzazione del
centrosoma spermatico.
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Pattern 1
Pattern 2
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Pattern 3
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SVILUPPO EMBRIONALE
L’embrione si sviluppa per una continua successione di:
Divisione citoplasmatica
Divisione cellulare
Il primo clivaggio è l’unica divisione sincrona che porta alla
formazione di due blastomeri uguali che contengono la stessa
allocazione dei due poli animale e vegetale dell’ovocita.
Nel caso in cui essa si verifichi a 24 – 27h
dall’inseminazione, si parla di Early
Cleavage
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SVILUPPO EMBRIONALE
Il secondo clivaggio è invece asincrono e associato ad una
rotazione che porta alla formazione di un embrione a 4
cellule. Tutti i successivi clivaggi sono asincroni e avvengono
sempre nello spazio delimitato dalla zona pellucida
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Il criterio di valutazione della qualità
embrionale è principalmente morfologico:
N° e grandezza dei blastomeri
Assenza di frammentazioni
Assenza di multinucleazioni
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L’embrione viene sempre osservato all’invertoscopio e si esegue una
classificazione
Un ineguale clivaggio cellulare
è un indicatore della qualità
embrionaria
e
della
sua
capacità di sviluppo
sviluppo..
Conseguenze:
Ineguale
distribuzione
di
mRNA, mitocondri e organelli
citoplasmatici tra le due cellule
gemelle..
gemelle
Un embrione è considerato di
buona qualità quando presenta
4 cellule in II
II°° giornata (3636-50 h
dall’insemin..) e 6-8 cellule in III
dall’insemin
III°°
giornata (72 h dall’insem
dall’insem..)
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GRADO I
Cellule di uguale
grandezza
Assenza di frammenti
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Ben espanse
nello spazio
perivitellino
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GRADO I
10…20% frammenti
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GRADO II
• Cellule di grandezza simile
ma con una differenza non
superiore al 20% tra l’una
e l’altra
• 20 – 50% di
frammentazione
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GRADO III
• Cellule con una differenza nelle
dimensioni dei blastomeri superiore
al 20% tra l’uno e l’altro
• > 50% di frammentazione
• Basso numero di cellule rispetto
a quelle attese
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Il criterio principale di selezione embrionale si
basa su valutazioni morfologiche:
N° e grandezza dei blastomeri
Assenza di frammentazioni
Assenza di multinucleazioni
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Classificazione
Descrizione
Tipo I
Frammentazione minima
Tipo II
Frammenti localizzati perifericamente
allo PVS
Tipo III
Piccoli frammenti sparsi tra le cellule o
in tutto il PVS
Tipo IV
Grandi frammenti,blastomeri di
differente misura
Molti preembrioni contengono frammenti cellulari nello pvs
per le continue modificazioni di forma e rottura dei blastomeri
durante la loro divisione.
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Il criterio principale di selezione embrionale si
basa su valutazioni morfologiche:
N° e grandezza dei blastomeri
Assenza di frammentazioni
Assenza di multinucleazioni
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Presenza di due o più nuclei nei blastomeri
Presenti in circa il 30% di embrioni
Multinucleazioni
Assenza di citochine
Cause
Parziale frammentazione di nuclei
Difetti nella migrazione dei cromosomi
“… Since mulinucleation in early embryos may reflect
gross chromosomal abnormalities or development of
mosaic embryos, it is advisable not to replace embryos
with MNB.
MNB. Occasional transfers, however can be
considered because defective embryos may sometimes
develop normally.
normally.”
Balakier et al., Hum. Rep., 1997
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P
I
T
T
I
N
G
Desai et al, 2000
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ASPETTO DEL CITOPLASMA
La presenza di granulosità nel citoplasma
pare non sia correlato con la morfologia
dell’embrione e quindi che non abbia
impatto sulla percentuale di impianto
(Rienzi et al. 2003).
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Dal
giorno +3...
FASI DELLO
SVILUPPO
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..Alla
blastocisti
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Giorno +4 : COMPATTAZIONE
I singoli blastomeri non sono distinguibili
Le cellule della morula compattata
iniziano a polarizzarsi.
Si vede l’inizio della cavitazione
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Giorno +5 : CAVITAZIONE ED ESPANSIONE
Inizia la formazione del blastocele.
L’embrione aumenta di volume e
la ZP si assottiglia.
TE e ICM divengono identificabili.
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Giorno +6 : ESPANSIONE
Il volume del blastocele aumenta.
La ZP si assottiglia.
L’embrione accresce il suo volume.
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Giorno +6 / +7 : HATCHING
L’embrione continua ad aumentare
di volume.
Si crea una breccia nella ZP e inizia
a fuoriuscire una porzione di TE.
L’embrione “sguscia” completamente
dalla ZP e si rigonfia.
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Prolungare la coltura in vitro fino al
giorno +5 e trasferire gli embrioni a
blastocisti non è una strategia
che può migliorare i risultati di un
programma di PMA.
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